عزل وثقافة البلاعم المشتقة من نخاع العظام من الفئران
Summary
يصف هذا البروتوكول عزل وثقافة البلاعم المشتقة من نخاع العظم من الفئران.
Abstract
للبلاعم الكبيرة وظائف مستجيبة مهمة في الاتزان الداخلي والالتهاب. هذه الخلايا موجودة في كل نسيج في الجسم ولديها القدرة الهامة على تغيير ملفها الشخصي وفقا للمنبهات الموجودة في البيئة المكروية. يمكن أن تؤثر السيتوكينات بشكل عميق على فسيولوجيا البلاعم ، وخاصة IFN-γ و interleukin 4 ، مما يولد أنواع M1 و M2 على التوالي. بسبب تعدد استخدامات هذه الخلايا ، يمكن أن يكون إنتاج مجموعة من الضامة المشتقة من نخاع العظم خطوة أساسية في العديد من النماذج التجريبية لبيولوجيا الخلية. الهدف من هذا البروتوكول هو مساعدة الباحثين في عزل وثقافة البلاعم المشتقة من أسلاف نخاع العظام. يتم تحويل أسلاف نخاع العظم من الفئران C57BL / 6 الخالية من مسببات الأمراض إلى بلاعم عند التعرض لعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF) الذي يتم الحصول عليه في هذا البروتوكول من طاف سلالة الخلايا الليفية للفأرة L-929. بعد الحضانة ، تتوفر البلاعم الناضجة للاستخداممن اليوم 7 إلى اليوم 10. يمكن أن يكون واحد مصدرا لما يقرب من 2 × 107 البلاعم. لذلك ، فهو بروتوكول مثالي للحصول على كميات كبيرة من البلاعم الأولية باستخدام الطرق الأساسية لزراعة الخلايا.
Introduction
الخلايا الوحيدة والبلاعم هي خلايا بلعمية أحادية النواة يمكن اشتقاقها من السلف الموجود في نخاع العظم. أفادت الدراسات الحديثة أن البلاعم تنشأ أيضا من أسلاف الكريات الحمر النخاعيةالمشتقة من كيس الصفار 1. بغض النظر عن اشتقاقها ، فإن كريات الدم البيضاء هذه لها وظائف مستجيبة مهمة في التوازن والالتهاب 2,3. الخلايا الوحيدة هي خلايا من الدم المحيطي يمكن أن تتمايز بشكل أكبر إلى بلاعم في الأنسجة 2,4 ، في حين أن البلاعم هي خلايا غير متجانسة تظهر أنماطا ظاهرية ووظائف ينظمها التعرض المحلي لعوامل النمو والسيتوكينات5. نظرا لأن البلاعم تظهر مثل هذا التنوع الوظيفي ، فقد تمت دراستها في العديد من نماذج الأمراض. وهكذا ، أصبحت ثقافة البلاعم في المختبر أداة مهمة لفهم فسيولوجيتها ودورها في الأمراض المختلفة. يعد نخاع العظم مصدرا مهما للخلايا السلفية ، بما في ذلك أسلاف البلاعم ، والتي يمكن عزلها ومضاعفتها ، مما يزيد بشكل كبير من عدد البلاعم التي تم الحصول عليها. بالإضافة إلى ذلك ، تعتبر البلاعم المشتقة من نخاع العظم مهمة بشكل خاص لتجنب التأثيرات الناتجة عن البيئة المكروية للأنسجة ، لأن البلاعم تغير نمطها الظاهري استجابة للمنبهات المختلفة في الأنسجة 6,7. تتحول أسلاف نخاع العظم إلى بلاعم عند التعرض لعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF)8. لا يمكن تمييز البلاعم المشتقة من نخاع العظم عن الضامة المشتقة من الخلايا الوحيدة بواسطة علامات كيميائية حيوية في الأنسجة. تمثل هذه الخلايا مجموعة متجانسة للغاية من الخلايا الأولية ، والتي يمكن مقارنتها في كثير من النواحي الأخرى بالبلاعم البريتونية 6,9.
بسبب مجموعة الوظائف الخلوية غير المتجانسة ، تمت دراسة البلاعم بدقة من قبل الباحثين. يمكن استخدام هذه الخلايا في نماذج تجريبية مختلفة ، بما في ذلك الأمراض المعدية والالتهابية ، لأنها تظهر في هذه العمليات 10,11. يمكن أن تكون مفيدة أيضا للتحقيق في استقطاب البلاعم استجابة لمختلف المحفزات البيئية الدقيقة12,13. وبالتالي ، يتم توفير بروتوكول بسيط وموثوق هنا لغرض الحصول على أعداد كبيرة من الضامة الأولية من نخاع عظم الفأر.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد إنتاج مجموعة من البلاعم المشتقة من نخاع العظم خطوة أساسية في العديد من النماذج التجريبية لبيولوجيا الخلية ، خاصة عندما يكون من المهم تحقيق مجموعة متجانسة من الخلايا الأولية. كما ذكرنا ، يمكن أن تتحول أسلاف الخلايا إلى بلاعم فقط في وجود M-CSF. يمكن استخدام طافات الخلايا L-929 كمصدر رئيسي ل M-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل بمنح من مؤسسة أمبارو à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) ، من خلال Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) و Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular – REMETTEC (RED-00570-16) ، والمجلس الوطني البرازيلي للتنمية العلمية والتكنولوجية (CNPq).
Materials
| 20-cc syringe | DESCARPACK | SI100S4G | Sterile syringe |
| 26-G needles | BD | 497AQDKT7 | Sterile needles |
| 50-ml conical centrifuge tube | SARSTEDT | 62547254 | Plastic conical tubes suitable for centrifugation |
| 70% ethanol solution | EMFAL | 490 | Ethanol solution for esterilization |
| Anatomical dissection forceps | 3B SCIENTIFIC | W1670 | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| C57Bl/6 wild type mouse | Purchased from Biotério Central at Federal University of Minas Gerais | Not applicable | Mice must be specific-pathogen-free, age between 6 and 10 weeks. Mice need be accommodated at least one week earlier for recovering from the stress of transportation |
| Cell culture flask T175 | GREINER | C7481-50EA | T-175 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Cell culture flask T75 | GREINER | C7231-120EA | T-75 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Disinfecting or baby Wipes₁ | CLOROX | Not applicable | It helps cleaning the bone |
| Distilled Water | GIBCO | 15230 | Sterile distilled water |
| DMEM/F12-10 | Not applicable | Not applicable | Add 10 mL of Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 mL of Penicillin/ Streptomycin (P/S) to DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL) |
| DMEM/F12-10 + supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | Add 20% of supernatant of L929 cells culture on DMEM/F-12-10 |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – F12 (DMEM/F12) | GIBCO | 12500096 | DMEM: F-12 Medium contains 2.5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, and 1200 mg/L sodium bicarbonate.Resuspend powder to 1 liter of distilled water and add 3,7 g of sodium bicarbonate. Adjust pH to 7,2 and filter with 0,22 µM. Storage at 2 – 8 °C freezer |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States (FBS) | GIBCO | 10082147 | Enrichment for DMEM-F12 |
| Hemocytometer | SIGMA-ALDRICH | Z359629 | Used to count macrophages at microscopy |
| L-929 cells | SIGMA-ALDRICH | ATCC # CCL-1 | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF) |
| Nikon TI eclipse | NIKON | Not applicable | Nikon TI Eclipse is a fluorescence and phase contrast microscope |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | CELLSTRIPER (CORNING) | 25-056-CI | Non-enzimatic cell dissociation solution remove macrophages from the plate without damaging them |
| Non-treated round culture dishes 100 × 20–mm | CORNING | CLS430591 | Do not use tissue culture treated petri dishes or any tissue culture treated plate |
| P3199 Penicillin G Potassium Salt | USBIOLOGICAL | 113-98-4 | Antibiotics |
| Penicillin and streptomycin (P/S) solution | Use 0,26 grams of penicillin and 0,40 grams of streptomycin. Mix with 40 mL of sterile PBS. Inside a horizontal laminar flow cabinet, use a 0,22 µM filter and store aliquots of 1.0 mL in 1.5 ml microfuge tubes in the freezer (-20°C) | ||
| Phosphate Buffered Saline free from Calcium and Magnesium (PBS) | MEDIATECH | 21-040-CM | Sterile |
| S7975 Streptomycin Sulfate, 650-850U/mg | USBIOLOGICAL | 3810-74-0 | Antibiotics |
| Serological pipettes of 10mL or 25 mL | SARSTEDT | 861254001 | Serological pipettes is used volumes higher than 1 mL |
| Sodium Bicarbonate | SIGMA-ALDRICH | 144-55-8 | pH correction for DMEM-F12 |
| Software Nis Elements Viewer | NIKON | Not applicable | NIS-Elements Viewer is a free standalone program to view image files and datasets |
| Sterile PBS and 2% of P/S solution | LABORCRIN | 590338 | Add 1 mL of P/S in 40 mL of sterile PBS |
| Straight iris scissors | KATENA | Not applicable | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| Supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF). L-929 supernatant was obtain from the protocol |
| Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel | SWANN-MORTON | 311 | Used for exposing epiphysis from bones |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | GIBCO | 15250061 | Trypan Blue Solution, 0.4%, is routinely used as a cell stain to assess cell viability using the dye exclusion test |
| Trypsin/EDTA solution 0,05% | GIBCO | 25300-062 | Used to dissociate cells from culture bottle |
| Water for Injection (WFI) for Cell Culture | GIBCO | A12873 | Sterile and endotoxin-free water |
References
- Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- van Furth, R., Cohn, Z. A. The origin and kinetics of mononuclear phagocytes. The Journal of Experimental Medicine. 128 (3), 415-435 (1968).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454 (7203), 428-435 (2008).
- Shapouri-Moghaddam, A., et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6425-6440 (2018).
- Davies, J. Q., Gordon, S. Isolation and culture of murine macrophages. Methods in Molecular Biology. 290, 91-103 (2005).
- Jin, X., Kruth, H. S. Culture of macrophage colony-stimulating factor differentiated human monocyte-derived macrophages. Journal of Visualized Experiments. (112), e54244 (2016).
- Gonçalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-16 (2015).
- Varol, C., Mildner, A., Jung, S. Macrophages: development and tissue specialization. Annual Review of Immunology. 33, 643-675 (2015).
- Andrés, V., Pello, O. M., Silvestre-Roig, C. Macrophage proliferation and apoptosis in atherosclerosis. Current Opinion in Lipidology. 23 (5), 429-438 (2012).
- Pineda-Torra, I., Gage, M., de Juan, A., Pello, O. M. Isolation, culture, and polarization of murine bone marrow-derived and peritoneal macrophages. Methods in Molecular Biology. 1339, 101-109 (2015).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. Journal of Leukocyte Biology. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hamczyk, M. R., Villa-Bellosta, R., Andrés, V. In vitro macrophage phagocytosis assay. Methods in Molecular Biology. 1339, 235-246 (2015).
- Hosoe, S., et al. Induction of tumoricidal macrophages from bone marrow cells of normal mice or mice bearing a colony-stimulating-factor-producing tumor. Cancer Immunology, Immunotherapy. 28 (2), 116-122 (1989).
- Rice, H. M., et al. rM-CSF efficiently replaces L929 in generating mouse and rat bone marrow-derived macrophages for in vitro functional studies of immunity to intracellular bacteria. Journal of Immunological Methods. 477, 112693 (2020).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone marrow-derived macrophages (BMM): isolation and applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (12), (2008).
- Austin, P. E., Mcculloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
- Stanley, E. R. Macrophage colony-stimulating factor (CSF-1). Encyclopedia of Immunology. 116 (1983), 1650-1654 (1998).
- Bou Ghosn, E. E., et al. Two physically, functionally, and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (6), 2568-2573 (2010).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
