Isolamento e coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo da topi
Summary
Il presente protocollo descrive l’isolamento e la coltura di macrofagi derivati dal midollo osseo dai topi.
Abstract
I macrofagi hanno importanti funzioni effettrici nell’omeostasi e nell’infiammazione. Queste cellule sono presenti in ogni tessuto del corpo e hanno l’importante capacità di modificare il loro profilo in base agli stimoli presenti nel microambiente. Le citochine possono influenzare profondamente la fisiologia dei macrofagi, in particolare l’IFN-γ e l’interleuchina 4, generando rispettivamente i tipi M1 e M2. A causa della versatilità di queste cellule, la produzione di una popolazione di macrofagi derivati dal midollo osseo può essere un passo fondamentale in molti modelli sperimentali di biologia cellulare. Lo scopo di questo protocollo è quello di aiutare i ricercatori nell’isolamento e nella coltura di macrofagi derivati da progenitori del midollo osseo. I progenitori del midollo osseo di topi C57BL/6 privi di patogeni vengono trasformati in macrofagi dopo l’esposizione al fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF) che, in questo protocollo, è ottenuto dal surnatante della linea di fibroblasti murini L-929. Dopo l’incubazione, i macrofagi maturi sono disponibili per l’uso dal 7° al 10° giorno. Un singolo animale può essere la fonte di circa 2 x 107 macrofagi. Pertanto, è un protocollo ideale per ottenere grandi quantità di macrofagi primari utilizzando metodi di base di coltura cellulare.
Introduction
I monociti e i macrofagi sono fagociti mononucleati che possono essere derivati dai progenitori nel midollo osseo. Studi recenti hanno riportato che i macrofagi hanno origine anche da progenitori eritro-mieloidi derivati dal sacco vitellino1. Indipendentemente dalla loro derivazione, questi leucociti hanno importanti funzioni effettrici nell’omeostasi e nell’infiammazione 2,3. I monociti sono cellule del sangue periferico che possono differenziarsi ulteriormente in macrofagi nel tessuto 2,4, mentre i macrofagi sono cellule eterogenee che presentano fenotipi e funzioni regolate dall’esposizione locale di fattori di crescita e citochine5. Poiché i macrofagi mostrano tale diversità funzionale, sono stati studiati in molti modelli di malattia. Pertanto, la coltura in vitro dei macrofagi è diventata uno strumento importante per comprendere la loro fisiologia e il loro ruolo in diverse malattie. Il midollo osseo è un’importante fonte di cellule progenitrici, compresi i progenitori dei macrofagi, che possono essere isolati e moltiplicati, aumentando esponenzialmente il numero di macrofagi ottenuti. Inoltre, i macrofagi derivati dal midollo osseo sono particolarmente importanti per evitare gli effetti generati dal microambiente tissutale, poiché i macrofagi cambiano il loro fenotipo in risposta a diversi stimoli nei tessuti 6,7. I progenitori del midollo osseo si trasformano in macrofagi in seguito all’esposizione al fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF)8. I macrofagi derivati dal midollo osseo non possono essere distinti dai macrofagi derivati dai monociti mediante marcatori biochimici nei tessuti. Queste cellule rappresentano una popolazione altamente omogenea di cellule primarie, che per molti altri aspetti sono paragonabili ai macrofagi peritoneali 6,9.
A causa del loro insieme eterogeneo di funzioni cellulari, i macrofagi sono stati a lungo studiati a fondo dai ricercatori. Queste cellule possono essere utilizzate in diversi modelli sperimentali, comprese le malattie infettive e infiammatorie, poiché sono presenti in questi processi10,11. Possono anche essere utili per studiare la polarizzazione dei macrofagi in risposta a vari stimoli microambientali 12,13. Pertanto, viene fornito un protocollo semplice e affidabile allo scopo di ottenere un numero elevato di macrofagi primari dal midollo osseo di topo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La produzione di una popolazione di macrofagi derivati dal midollo osseo è un passo fondamentale in molti modelli sperimentali di biologia cellulare, soprattutto quando è importante ottenere una popolazione omogenea di cellule primarie. Come accennato, i progenitori cellulari possono trasformarsi in macrofagi solo in presenza di M-CSF. I surnatanti cellulari L-929 possono essere utilizzati come fonte principale di M-CSF. A parte il costo, non ci sono problemi nell’utilizzare l’M-CSF ricombinante stesso<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), della Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) e della Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular – REMETTEC (RED-00570-16), e del Consiglio Nazionale Brasiliano per lo Sviluppo Scientifico e Tecnologico (CNPq).
Materials
| 20-cc syringe | DESCARPACK | SI100S4G | Sterile syringe |
| 26-G needles | BD | 497AQDKT7 | Sterile needles |
| 50-ml conical centrifuge tube | SARSTEDT | 62547254 | Plastic conical tubes suitable for centrifugation |
| 70% ethanol solution | EMFAL | 490 | Ethanol solution for esterilization |
| Anatomical dissection forceps | 3B SCIENTIFIC | W1670 | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| C57Bl/6 wild type mouse | Purchased from Biotério Central at Federal University of Minas Gerais | Not applicable | Mice must be specific-pathogen-free, age between 6 and 10 weeks. Mice need be accommodated at least one week earlier for recovering from the stress of transportation |
| Cell culture flask T175 | GREINER | C7481-50EA | T-175 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Cell culture flask T75 | GREINER | C7231-120EA | T-75 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Disinfecting or baby Wipes₁ | CLOROX | Not applicable | It helps cleaning the bone |
| Distilled Water | GIBCO | 15230 | Sterile distilled water |
| DMEM/F12-10 | Not applicable | Not applicable | Add 10 mL of Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 mL of Penicillin/ Streptomycin (P/S) to DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL) |
| DMEM/F12-10 + supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | Add 20% of supernatant of L929 cells culture on DMEM/F-12-10 |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – F12 (DMEM/F12) | GIBCO | 12500096 | DMEM: F-12 Medium contains 2.5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, and 1200 mg/L sodium bicarbonate.Resuspend powder to 1 liter of distilled water and add 3,7 g of sodium bicarbonate. Adjust pH to 7,2 and filter with 0,22 µM. Storage at 2 – 8 °C freezer |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States (FBS) | GIBCO | 10082147 | Enrichment for DMEM-F12 |
| Hemocytometer | SIGMA-ALDRICH | Z359629 | Used to count macrophages at microscopy |
| L-929 cells | SIGMA-ALDRICH | ATCC # CCL-1 | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF) |
| Nikon TI eclipse | NIKON | Not applicable | Nikon TI Eclipse is a fluorescence and phase contrast microscope |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | CELLSTRIPER (CORNING) | 25-056-CI | Non-enzimatic cell dissociation solution remove macrophages from the plate without damaging them |
| Non-treated round culture dishes 100 × 20–mm | CORNING | CLS430591 | Do not use tissue culture treated petri dishes or any tissue culture treated plate |
| P3199 Penicillin G Potassium Salt | USBIOLOGICAL | 113-98-4 | Antibiotics |
| Penicillin and streptomycin (P/S) solution | Use 0,26 grams of penicillin and 0,40 grams of streptomycin. Mix with 40 mL of sterile PBS. Inside a horizontal laminar flow cabinet, use a 0,22 µM filter and store aliquots of 1.0 mL in 1.5 ml microfuge tubes in the freezer (-20°C) | ||
| Phosphate Buffered Saline free from Calcium and Magnesium (PBS) | MEDIATECH | 21-040-CM | Sterile |
| S7975 Streptomycin Sulfate, 650-850U/mg | USBIOLOGICAL | 3810-74-0 | Antibiotics |
| Serological pipettes of 10mL or 25 mL | SARSTEDT | 861254001 | Serological pipettes is used volumes higher than 1 mL |
| Sodium Bicarbonate | SIGMA-ALDRICH | 144-55-8 | pH correction for DMEM-F12 |
| Software Nis Elements Viewer | NIKON | Not applicable | NIS-Elements Viewer is a free standalone program to view image files and datasets |
| Sterile PBS and 2% of P/S solution | LABORCRIN | 590338 | Add 1 mL of P/S in 40 mL of sterile PBS |
| Straight iris scissors | KATENA | Not applicable | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| Supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF). L-929 supernatant was obtain from the protocol |
| Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel | SWANN-MORTON | 311 | Used for exposing epiphysis from bones |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | GIBCO | 15250061 | Trypan Blue Solution, 0.4%, is routinely used as a cell stain to assess cell viability using the dye exclusion test |
| Trypsin/EDTA solution 0,05% | GIBCO | 25300-062 | Used to dissociate cells from culture bottle |
| Water for Injection (WFI) for Cell Culture | GIBCO | A12873 | Sterile and endotoxin-free water |
References
- Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- van Furth, R., Cohn, Z. A. The origin and kinetics of mononuclear phagocytes. The Journal of Experimental Medicine. 128 (3), 415-435 (1968).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454 (7203), 428-435 (2008).
- Shapouri-Moghaddam, A., et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6425-6440 (2018).
- Davies, J. Q., Gordon, S. Isolation and culture of murine macrophages. Methods in Molecular Biology. 290, 91-103 (2005).
- Jin, X., Kruth, H. S. Culture of macrophage colony-stimulating factor differentiated human monocyte-derived macrophages. Journal of Visualized Experiments. (112), e54244 (2016).
- Gonçalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-16 (2015).
- Varol, C., Mildner, A., Jung, S. Macrophages: development and tissue specialization. Annual Review of Immunology. 33, 643-675 (2015).
- Andrés, V., Pello, O. M., Silvestre-Roig, C. Macrophage proliferation and apoptosis in atherosclerosis. Current Opinion in Lipidology. 23 (5), 429-438 (2012).
- Pineda-Torra, I., Gage, M., de Juan, A., Pello, O. M. Isolation, culture, and polarization of murine bone marrow-derived and peritoneal macrophages. Methods in Molecular Biology. 1339, 101-109 (2015).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. Journal of Leukocyte Biology. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hamczyk, M. R., Villa-Bellosta, R., Andrés, V. In vitro macrophage phagocytosis assay. Methods in Molecular Biology. 1339, 235-246 (2015).
- Hosoe, S., et al. Induction of tumoricidal macrophages from bone marrow cells of normal mice or mice bearing a colony-stimulating-factor-producing tumor. Cancer Immunology, Immunotherapy. 28 (2), 116-122 (1989).
- Rice, H. M., et al. rM-CSF efficiently replaces L929 in generating mouse and rat bone marrow-derived macrophages for in vitro functional studies of immunity to intracellular bacteria. Journal of Immunological Methods. 477, 112693 (2020).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone marrow-derived macrophages (BMM): isolation and applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (12), (2008).
- Austin, P. E., Mcculloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
- Stanley, E. R. Macrophage colony-stimulating factor (CSF-1). Encyclopedia of Immunology. 116 (1983), 1650-1654 (1998).
- Bou Ghosn, E. E., et al. Two physically, functionally, and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (6), 2568-2573 (2010).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
