Isolamento e cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos
Summary
O presente protocolo descreve o isolamento e a cultura de macrófagos derivados da medula óssea de camundongos.
Abstract
Os macrófagos têm importantes funções efetoras na homeostase e inflamação. Essas células estão presentes em todos os tecidos do corpo e têm a importante capacidade de alterar seu perfil de acordo com os estímulos presentes no microambiente. As citocinas podem afetar profundamente a fisiologia dos macrófagos, especialmente o IFN-γ e a interleucina 4, gerando os tipos M1 e M2, respectivamente. Devido à versatilidade dessas células, a produção de uma população de macrófagos derivados da medula óssea pode ser uma etapa básica em muitos modelos experimentais de biologia celular. O objetivo deste protocolo é auxiliar os pesquisadores no isolamento e cultivo de macrófagos derivados de progenitores da medula óssea. Progenitores de medula óssea de camundongos C57BL/6 livres de patógenos são transformados em macrófagos após exposição ao fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) que, neste protocolo, é obtido do sobrenadante da linhagem de fibroblastos murinos L-929. Após a incubação, os macrófagos maduros estão disponíveis para uso do7º ao10º dia. Um único animal pode ser a fonte de aproximadamente 2 x 107 macrófagos. Portanto, é um protocolo ideal para a obtenção de grandes quantidades de macrófagos primários usando métodos básicos de cultura celular.
Introduction
Monócitos e macrófagos são fagócitos mononucleares que podem ser derivados de progenitores na medula óssea. Estudos recentes relataram que os macrófagos também se originam de progenitores eritromielóides derivados do saco vitelino1. Independentemente de sua derivação, esses leucócitos têm importantes funções efetoras na homeostase e inflamação 2,3. Os monócitos são células do sangue periférico que podem se diferenciar ainda mais em macrófagos no tecido 2,4, enquanto os macrófagos são células heterogêneas que exibem fenótipos e funções reguladas pela exposição local de fatores de crescimento e citocinas5. Como os macrófagos apresentam essa diversidade funcional, eles têm sido estudados em muitos modelos de doenças. Assim, o cultivo in vitro de macrófagos tornou-se uma importante ferramenta para a compreensão de sua fisiologia e seu papel em diferentes doenças. A medula óssea é uma importante fonte de células progenitoras, incluindo progenitores de macrófagos, que podem ser isoladas e multiplicadas, aumentando exponencialmente o número de macrófagos obtidos. Além disso, os macrófagos derivados da medula óssea são especialmente importantes para evitar os efeitos gerados pelo microambiente tecidual, uma vez que os macrófagos mudam seu fenótipo em resposta a diferentes estímulos nos tecidos 6,7. Os progenitores da medula óssea se transformam em macrófagos após a exposição ao fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF)8. Os macrófagos derivados da medula óssea não podem ser distinguidos dos macrófagos derivados de monócitos por marcadores bioquímicos no tecido. Essas células representam uma população altamente homogênea de células primárias, que em muitos outros aspectos são comparáveis aos macrófagos peritoneais 6,9.
Devido ao seu conjunto heterogêneo de funções celulares, os macrófagos há muito são exaustivamente estudados pelos pesquisadores. Essas células podem ser utilizadas em diferentes modelos experimentais, incluindo doenças infecciosas e inflamatórias, pois estão presentes nesses processos10,11. Eles também podem ser úteis para investigar a polarização de macrófagos em resposta a vários estímulos microambientais12,13. Assim, um protocolo simples e confiável é fornecido aqui com o objetivo de obter um grande número de macrófagos primários da medula óssea de camundongos.
Protocol
Representative Results
Discussion
A produção de uma população de macrófagos derivados da medula óssea é uma etapa básica em muitos modelos experimentais de biologia celular, especialmente quando é importante alcançar uma população homogênea de células primárias. Como mencionado, os progenitores celulares só podem se transformar em macrófagos na presença de M-CSF. Os sobrenadantes de células L-929 podem ser usados como a principal fonte de M-CSF. Além do custo, não há problema em usar o próprio M-CSF recombinante</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por bolsas da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), por meio da Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) e Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular – REMETTEC (RED-00570-16), e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
Materials
| 20-cc syringe | DESCARPACK | SI100S4G | Sterile syringe |
| 26-G needles | BD | 497AQDKT7 | Sterile needles |
| 50-ml conical centrifuge tube | SARSTEDT | 62547254 | Plastic conical tubes suitable for centrifugation |
| 70% ethanol solution | EMFAL | 490 | Ethanol solution for esterilization |
| Anatomical dissection forceps | 3B SCIENTIFIC | W1670 | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| C57Bl/6 wild type mouse | Purchased from Biotério Central at Federal University of Minas Gerais | Not applicable | Mice must be specific-pathogen-free, age between 6 and 10 weeks. Mice need be accommodated at least one week earlier for recovering from the stress of transportation |
| Cell culture flask T175 | GREINER | C7481-50EA | T-175 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Cell culture flask T75 | GREINER | C7231-120EA | T-75 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Disinfecting or baby Wipes₁ | CLOROX | Not applicable | It helps cleaning the bone |
| Distilled Water | GIBCO | 15230 | Sterile distilled water |
| DMEM/F12-10 | Not applicable | Not applicable | Add 10 mL of Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 mL of Penicillin/ Streptomycin (P/S) to DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL) |
| DMEM/F12-10 + supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | Add 20% of supernatant of L929 cells culture on DMEM/F-12-10 |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – F12 (DMEM/F12) | GIBCO | 12500096 | DMEM: F-12 Medium contains 2.5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, and 1200 mg/L sodium bicarbonate.Resuspend powder to 1 liter of distilled water and add 3,7 g of sodium bicarbonate. Adjust pH to 7,2 and filter with 0,22 µM. Storage at 2 – 8 °C freezer |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States (FBS) | GIBCO | 10082147 | Enrichment for DMEM-F12 |
| Hemocytometer | SIGMA-ALDRICH | Z359629 | Used to count macrophages at microscopy |
| L-929 cells | SIGMA-ALDRICH | ATCC # CCL-1 | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF) |
| Nikon TI eclipse | NIKON | Not applicable | Nikon TI Eclipse is a fluorescence and phase contrast microscope |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | CELLSTRIPER (CORNING) | 25-056-CI | Non-enzimatic cell dissociation solution remove macrophages from the plate without damaging them |
| Non-treated round culture dishes 100 × 20–mm | CORNING | CLS430591 | Do not use tissue culture treated petri dishes or any tissue culture treated plate |
| P3199 Penicillin G Potassium Salt | USBIOLOGICAL | 113-98-4 | Antibiotics |
| Penicillin and streptomycin (P/S) solution | Use 0,26 grams of penicillin and 0,40 grams of streptomycin. Mix with 40 mL of sterile PBS. Inside a horizontal laminar flow cabinet, use a 0,22 µM filter and store aliquots of 1.0 mL in 1.5 ml microfuge tubes in the freezer (-20°C) | ||
| Phosphate Buffered Saline free from Calcium and Magnesium (PBS) | MEDIATECH | 21-040-CM | Sterile |
| S7975 Streptomycin Sulfate, 650-850U/mg | USBIOLOGICAL | 3810-74-0 | Antibiotics |
| Serological pipettes of 10mL or 25 mL | SARSTEDT | 861254001 | Serological pipettes is used volumes higher than 1 mL |
| Sodium Bicarbonate | SIGMA-ALDRICH | 144-55-8 | pH correction for DMEM-F12 |
| Software Nis Elements Viewer | NIKON | Not applicable | NIS-Elements Viewer is a free standalone program to view image files and datasets |
| Sterile PBS and 2% of P/S solution | LABORCRIN | 590338 | Add 1 mL of P/S in 40 mL of sterile PBS |
| Straight iris scissors | KATENA | Not applicable | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| Supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF). L-929 supernatant was obtain from the protocol |
| Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel | SWANN-MORTON | 311 | Used for exposing epiphysis from bones |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | GIBCO | 15250061 | Trypan Blue Solution, 0.4%, is routinely used as a cell stain to assess cell viability using the dye exclusion test |
| Trypsin/EDTA solution 0,05% | GIBCO | 25300-062 | Used to dissociate cells from culture bottle |
| Water for Injection (WFI) for Cell Culture | GIBCO | A12873 | Sterile and endotoxin-free water |
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