Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü
Summary
Bu protokol, farelerden kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonunu ve kültürünü açıklamaktadır.
Abstract
Makrofajlar homeostaz ve inflamasyonda önemli efektör fonksiyonlara sahiptir. Bu hücreler vücuttaki her dokuda bulunur ve mikro çevrede bulunan uyaranlara göre profillerini değiştirme konusunda önemli bir yeteneğe sahiptir. Sitokinler, makrofaj fizyolojisini, özellikle IFN-γ ve interlökin 4’ü derinden etkileyerek sırasıyla M1 ve M2 tiplerini oluşturabilir. Bu hücrelerin çok yönlülüğü nedeniyle, kemik iliği türevli makrofaj popülasyonunun üretimi, hücre biyolojisinin birçok deneysel modelinde temel bir adım olabilir. Bu protokolün amacı, kemik iliği progenitörlerinden türetilen makrofajların izolasyonu ve kültüründe araştırmacılara yardımcı olmaktır. Patojen içermeyen C57BL / 6 farelerinden elde edilen kemik iliği progenitörleri, bu protokolde murin fibroblast soyunun L-929’un süpernatantından elde edilen makrofaj koloni uyarıcı faktöre (M-CSF) maruz kaldıklarında makrofajlara dönüştürülür. İnkübasyondan sonra, olgun makrofajlar 7. günden 10. güne kadar kullanılabilir. Tek bir hayvan yaklaşık 2 x 107 makrofajın kaynağı olabilir. Bu nedenle, temel hücre kültürü yöntemlerini kullanarak büyük miktarlarda primer makrofaj elde etmek için ideal bir protokoldür.
Introduction
Monositler ve makrofajlar, kemik iliğindeki progenitörlerden türetilebilen mononükleer fagositlerdir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda makrofajların yolk kesesi kaynaklı eritromiyeloid progenitörlerden de köken aldığı bildirilmiştir1. Türevlerinden bağımsız olarak, bu lökositlerin homeostaz ve inflamasyonda önemli efektör işlevleri vardır 2,3. Monositler, dokuda makrofajlara daha fazla farklılaşabilen periferik kandanalınan hücrelerdir 2,4, makrofajlar ise büyüme faktörlerinin ve sitokinlerin5 lokal maruziyeti ile düzenlenen fenotipler ve işlevler sergileyen heterojen hücrelerdir. Makrofajlar bu tür fonksiyonel çeşitlilik gösterdikleri için birçok hastalık modelinde incelenmiştir. Bu nedenle, makrofajların in vitro kültürü, fizyolojilerini ve farklı hastalıklardaki rollerini anlamak için önemli bir araç haline gelmiştir. Kemik iliği, elde edilen makrofaj sayısını katlanarak artıran, izole edilebilen ve çoğaltılabilen makrofaj progenitörleri de dahil olmak üzere önemli bir progenitör hücre kaynağıdır. Ek olarak, kemik iliği kaynaklı makrofajlar, doku mikroçevresi tarafından oluşturulan etkilerden kaçınmak için özellikle önemlidir, çünkü makrofajlar dokulardaki farklı uyaranlara yanıt olarak fenotiplerini değiştirir 6,7. Kemik iliği progenitörleri, makrofaj koloni uyarıcı faktöre (M-CSF) maruz kaldıklarında makrofajlara dönüşür8. Kemik iliği kaynaklı makrofajlar, dokudaki biyokimyasal belirteçler ile monosit kaynaklı makrofajlardan ayırt edilemez. Bu hücreler, diğer birçok açıdan peritoneal makrofajlarlakarşılaştırılabilir olan, oldukça homojen bir birincil hücre popülasyonunu temsil eder 6,9.
Heterojen hücresel fonksiyonları nedeniyle, makrofajlar uzun zamandır araştırmacılar tarafından kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu hücreler, bu süreçlerde yer aldıkları için bulaşıcı ve enflamatuar hastalıklar da dahil olmak üzere farklı deneysel modellerde kullanılabilir10,11. Çeşitli mikro-çevresel uyaranlara yanıt olarak makrofaj polarizasyonunu araştırmak için de yararlı olabilirler 12,13. Bu nedenle, fare kemik iliğinden yüksek sayıda primer makrofaj elde etmek amacıyla burada basit ve güvenilir bir protokol sağlanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kemik iliğinden türetilmiş bir makrofaj popülasyonu üretmek, özellikle homojen bir birincil hücre popülasyonu elde etmenin önemli olduğu durumlarda, birçok hücre biyolojisi deneysel modelinde temel bir adımdır. Belirtildiği gibi, hücre progenitörleri sadece M-CSF varlığında makrofajlara dönüşebilir. L-929 hücre süpernatantları, M-CSF’nin ana kaynağı olarak kullanılabilir. Maliyet dışında, rekombinant M-CSF’nin kendisinin kullanılmasında herhangi bir sorun yoktur <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) ve Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular – REMETTEC (RED-00570-16) ve Brezilya Ulusal Bilimsel ve Teknolojik Kalkınma Konseyi (CNPq) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir.
Materials
| 20-cc syringe | DESCARPACK | SI100S4G | Sterile syringe |
| 26-G needles | BD | 497AQDKT7 | Sterile needles |
| 50-ml conical centrifuge tube | SARSTEDT | 62547254 | Plastic conical tubes suitable for centrifugation |
| 70% ethanol solution | EMFAL | 490 | Ethanol solution for esterilization |
| Anatomical dissection forceps | 3B SCIENTIFIC | W1670 | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| C57Bl/6 wild type mouse | Purchased from Biotério Central at Federal University of Minas Gerais | Not applicable | Mice must be specific-pathogen-free, age between 6 and 10 weeks. Mice need be accommodated at least one week earlier for recovering from the stress of transportation |
| Cell culture flask T175 | GREINER | C7481-50EA | T-175 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Cell culture flask T75 | GREINER | C7231-120EA | T-75 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Disinfecting or baby Wipes₁ | CLOROX | Not applicable | It helps cleaning the bone |
| Distilled Water | GIBCO | 15230 | Sterile distilled water |
| DMEM/F12-10 | Not applicable | Not applicable | Add 10 mL of Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 mL of Penicillin/ Streptomycin (P/S) to DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL) |
| DMEM/F12-10 + supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | Add 20% of supernatant of L929 cells culture on DMEM/F-12-10 |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – F12 (DMEM/F12) | GIBCO | 12500096 | DMEM: F-12 Medium contains 2.5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, and 1200 mg/L sodium bicarbonate.Resuspend powder to 1 liter of distilled water and add 3,7 g of sodium bicarbonate. Adjust pH to 7,2 and filter with 0,22 µM. Storage at 2 – 8 °C freezer |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States (FBS) | GIBCO | 10082147 | Enrichment for DMEM-F12 |
| Hemocytometer | SIGMA-ALDRICH | Z359629 | Used to count macrophages at microscopy |
| L-929 cells | SIGMA-ALDRICH | ATCC # CCL-1 | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF) |
| Nikon TI eclipse | NIKON | Not applicable | Nikon TI Eclipse is a fluorescence and phase contrast microscope |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | CELLSTRIPER (CORNING) | 25-056-CI | Non-enzimatic cell dissociation solution remove macrophages from the plate without damaging them |
| Non-treated round culture dishes 100 × 20–mm | CORNING | CLS430591 | Do not use tissue culture treated petri dishes or any tissue culture treated plate |
| P3199 Penicillin G Potassium Salt | USBIOLOGICAL | 113-98-4 | Antibiotics |
| Penicillin and streptomycin (P/S) solution | Use 0,26 grams of penicillin and 0,40 grams of streptomycin. Mix with 40 mL of sterile PBS. Inside a horizontal laminar flow cabinet, use a 0,22 µM filter and store aliquots of 1.0 mL in 1.5 ml microfuge tubes in the freezer (-20°C) | ||
| Phosphate Buffered Saline free from Calcium and Magnesium (PBS) | MEDIATECH | 21-040-CM | Sterile |
| S7975 Streptomycin Sulfate, 650-850U/mg | USBIOLOGICAL | 3810-74-0 | Antibiotics |
| Serological pipettes of 10mL or 25 mL | SARSTEDT | 861254001 | Serological pipettes is used volumes higher than 1 mL |
| Sodium Bicarbonate | SIGMA-ALDRICH | 144-55-8 | pH correction for DMEM-F12 |
| Software Nis Elements Viewer | NIKON | Not applicable | NIS-Elements Viewer is a free standalone program to view image files and datasets |
| Sterile PBS and 2% of P/S solution | LABORCRIN | 590338 | Add 1 mL of P/S in 40 mL of sterile PBS |
| Straight iris scissors | KATENA | Not applicable | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| Supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF). L-929 supernatant was obtain from the protocol |
| Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel | SWANN-MORTON | 311 | Used for exposing epiphysis from bones |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | GIBCO | 15250061 | Trypan Blue Solution, 0.4%, is routinely used as a cell stain to assess cell viability using the dye exclusion test |
| Trypsin/EDTA solution 0,05% | GIBCO | 25300-062 | Used to dissociate cells from culture bottle |
| Water for Injection (WFI) for Cell Culture | GIBCO | A12873 | Sterile and endotoxin-free water |
References
- Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- van Furth, R., Cohn, Z. A. The origin and kinetics of mononuclear phagocytes. The Journal of Experimental Medicine. 128 (3), 415-435 (1968).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454 (7203), 428-435 (2008).
- Shapouri-Moghaddam, A., et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6425-6440 (2018).
- Davies, J. Q., Gordon, S. Isolation and culture of murine macrophages. Methods in Molecular Biology. 290, 91-103 (2005).
- Jin, X., Kruth, H. S. Culture of macrophage colony-stimulating factor differentiated human monocyte-derived macrophages. Journal of Visualized Experiments. (112), e54244 (2016).
- Gonçalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-16 (2015).
- Varol, C., Mildner, A., Jung, S. Macrophages: development and tissue specialization. Annual Review of Immunology. 33, 643-675 (2015).
- Andrés, V., Pello, O. M., Silvestre-Roig, C. Macrophage proliferation and apoptosis in atherosclerosis. Current Opinion in Lipidology. 23 (5), 429-438 (2012).
- Pineda-Torra, I., Gage, M., de Juan, A., Pello, O. M. Isolation, culture, and polarization of murine bone marrow-derived and peritoneal macrophages. Methods in Molecular Biology. 1339, 101-109 (2015).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. Journal of Leukocyte Biology. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hamczyk, M. R., Villa-Bellosta, R., Andrés, V. In vitro macrophage phagocytosis assay. Methods in Molecular Biology. 1339, 235-246 (2015).
- Hosoe, S., et al. Induction of tumoricidal macrophages from bone marrow cells of normal mice or mice bearing a colony-stimulating-factor-producing tumor. Cancer Immunology, Immunotherapy. 28 (2), 116-122 (1989).
- Rice, H. M., et al. rM-CSF efficiently replaces L929 in generating mouse and rat bone marrow-derived macrophages for in vitro functional studies of immunity to intracellular bacteria. Journal of Immunological Methods. 477, 112693 (2020).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone marrow-derived macrophages (BMM): isolation and applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (12), (2008).
- Austin, P. E., Mcculloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
- Stanley, E. R. Macrophage colony-stimulating factor (CSF-1). Encyclopedia of Immunology. 116 (1983), 1650-1654 (1998).
- Bou Ghosn, E. E., et al. Two physically, functionally, and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (6), 2568-2573 (2010).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
