בידוד ותרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד והתרבית של מקרופאגים שמקורם במח עצם מעכברים.
Abstract
למקרופאגים יש תפקידים משפיעים חשובים בהומאוסטזיס ובדלקת. תאים אלה נמצאים בכל רקמה בגוף ויש להם יכולת חשובה לשנות את הפרופיל שלהם בהתאם לגירויים הקיימים במיקרו-סביבה. ציטוקינים יכולים להשפיע עמוקות על הפיזיולוגיה של המקרופאגים, במיוחד IFN-γ ואינטרלוקין 4, ולייצר סוגי M1 ו-M2 בהתאמה. בגלל הרבגוניות של תאים אלה, ייצור אוכלוסייה של מקרופאגים שמקורם במח עצם יכול להיות צעד בסיסי במודלים ניסיוניים רבים של ביולוגיה של התא. מטרת פרוטוקול זה היא לסייע לחוקרים בבידוד ובתרבית של מקרופאגים שמקורם באבות מח עצם. אבות מח עצם מעכברי C57BL/6 נטולי פתוגן הופכים למקרופאגים עם חשיפה לגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF) אשר, בפרוטוקול זה, מתקבל מהסופרנאטנט של שושלת הפיברובלסטים L-929. לאחר הדגירה, מקרופאגים בוגרים זמינים לשימוש מהיוםה-7 עד היוםה-10 . בעל חיים בודד יכול להיות המקור של בערך 2 x 107 מקרופאגים. לכן, זהו פרוטוקול אידיאלי להשגת כמויות גדולות של מקרופאגים ראשוניים באמצעות שיטות בסיסיות של תרבית תאים.
Introduction
מונוציטים ומקרופאגים הם פאגוציטים חד-גרעיניים שניתן להפיק מאבות במוח העצם. מחקרים אחרונים דיווחו כי מקורם של מקרופאגים גם באבות אריתרו-מיאלואידים שמקורם בשק חלמון1. ללא קשר לגזירה שלהם, לויקוציטים אלה יש פונקציות השפעה חשובות בהומאוסטזיס ודלקת 2,3. מונוציטים הם תאים מדם היקפי שיכולים להתמיין עוד יותר למקרופאגים ברקמה 2,4, ואילו מקרופאגים הם תאים הטרוגניים המציגים פנוטיפים ותפקודים המווסתים על ידי חשיפה מקומית של גורמי גדילה וציטוקינים5. מאחר שהמקרופאגים מראים מגוון תפקודי כזה, הם נחקרו במודלים רבים של מחלות. כך הפכה תרבית המקרופאגים לכלי חשוב להבנת הפיזיולוגיה שלהם ותפקידם במחלות שונות. מח העצם הוא מקור חשוב לתאי אב, כולל אבות מקרופאגים, שניתן לבודד ולהכפיל, מה שמגדיל באופן אקספוננציאלי את מספר המקרופאגים המתקבלים. בנוסף, מקרופאגים שמקורם במח עצם חשובים במיוחד כדי למנוע את ההשפעות הנוצרות על ידי מיקרו-סביבה של רקמות, שכן מקרופאגים משנים את הפנוטיפ שלהם בתגובה לגירויים שונים ברקמות 6,7. אבות מח עצם הופכים למקרופאגים עם חשיפה לגורם מגרה מושבת מקרופאגים (M-CSF)8. לא ניתן להבדיל בין מקרופאגים שמקורם במח עצם לבין מקרופאגים שמקורם במונוציטים על ידי סמנים ביוכימיים ברקמות. תאים אלה מייצגים אוכלוסייה הומוגנית מאוד של תאים ראשוניים, שבמובנים רבים אחרים דומים למקרופאגים פריטוניאליים 6,9.
בגלל מערך התפקודים התאיים ההטרוגניים שלהם, מקרופאגים נחקרו זה מכבר ביסודיות על ידי חוקרים. תאים אלה יכולים לשמש במודלים ניסיוניים שונים, כולל מחלות זיהומיות ודלקתיות, כפי שהם מופיעים בתהליכים אלה10,11. הם יכולים גם להיות שימושיים לחקר קיטוב המקרופאגים בתגובה לגירויים מיקרו-סביבתיים שונים12,13. לפיכך, פרוטוקול פשוט ואמין מסופק כאן לצורך קבלת מספר גבוה של מקרופאגים ראשוניים ממח עצם עכבר.
Protocol
Representative Results
Discussion
יצירת אוכלוסייה של מקרופאגים שמקורם במח עצם היא צעד בסיסי במודלים ניסיוניים רבים של ביולוגיה של התא, במיוחד כאשר חשוב להשיג אוכלוסייה הומוגנית של תאים ראשוניים. כאמור, אבות התא יכולים להפוך למקרופאגים רק בנוכחות M-CSF. סופרנאטנטים של תאי L-929 יכולים לשמש כמקור העיקרי של M-CSF. מלבד העלות, אין בע?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ- Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), דרך Rede de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) ו- Rede Mineira de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular – REMETTEC (RED-00570-16), והמועצה הלאומית הברזילאית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq).
Materials
| 20-cc syringe | DESCARPACK | SI100S4G | Sterile syringe |
| 26-G needles | BD | 497AQDKT7 | Sterile needles |
| 50-ml conical centrifuge tube | SARSTEDT | 62547254 | Plastic conical tubes suitable for centrifugation |
| 70% ethanol solution | EMFAL | 490 | Ethanol solution for esterilization |
| Anatomical dissection forceps | 3B SCIENTIFIC | W1670 | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| C57Bl/6 wild type mouse | Purchased from Biotério Central at Federal University of Minas Gerais | Not applicable | Mice must be specific-pathogen-free, age between 6 and 10 weeks. Mice need be accommodated at least one week earlier for recovering from the stress of transportation |
| Cell culture flask T175 | GREINER | C7481-50EA | T-175 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Cell culture flask T75 | GREINER | C7231-120EA | T-75 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free |
| Disinfecting or baby Wipes₁ | CLOROX | Not applicable | It helps cleaning the bone |
| Distilled Water | GIBCO | 15230 | Sterile distilled water |
| DMEM/F12-10 | Not applicable | Not applicable | Add 10 mL of Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 mL of Penicillin/ Streptomycin (P/S) to DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL) |
| DMEM/F12-10 + supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | Add 20% of supernatant of L929 cells culture on DMEM/F-12-10 |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – F12 (DMEM/F12) | GIBCO | 12500096 | DMEM: F-12 Medium contains 2.5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, and 1200 mg/L sodium bicarbonate.Resuspend powder to 1 liter of distilled water and add 3,7 g of sodium bicarbonate. Adjust pH to 7,2 and filter with 0,22 µM. Storage at 2 – 8 °C freezer |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States (FBS) | GIBCO | 10082147 | Enrichment for DMEM-F12 |
| Hemocytometer | SIGMA-ALDRICH | Z359629 | Used to count macrophages at microscopy |
| L-929 cells | SIGMA-ALDRICH | ATCC # CCL-1 | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF) |
| Nikon TI eclipse | NIKON | Not applicable | Nikon TI Eclipse is a fluorescence and phase contrast microscope |
| Non-enzymatic cell dissociation solution | CELLSTRIPER (CORNING) | 25-056-CI | Non-enzimatic cell dissociation solution remove macrophages from the plate without damaging them |
| Non-treated round culture dishes 100 × 20–mm | CORNING | CLS430591 | Do not use tissue culture treated petri dishes or any tissue culture treated plate |
| P3199 Penicillin G Potassium Salt | USBIOLOGICAL | 113-98-4 | Antibiotics |
| Penicillin and streptomycin (P/S) solution | Use 0,26 grams of penicillin and 0,40 grams of streptomycin. Mix with 40 mL of sterile PBS. Inside a horizontal laminar flow cabinet, use a 0,22 µM filter and store aliquots of 1.0 mL in 1.5 ml microfuge tubes in the freezer (-20°C) | ||
| Phosphate Buffered Saline free from Calcium and Magnesium (PBS) | MEDIATECH | 21-040-CM | Sterile |
| S7975 Streptomycin Sulfate, 650-850U/mg | USBIOLOGICAL | 3810-74-0 | Antibiotics |
| Serological pipettes of 10mL or 25 mL | SARSTEDT | 861254001 | Serological pipettes is used volumes higher than 1 mL |
| Sodium Bicarbonate | SIGMA-ALDRICH | 144-55-8 | pH correction for DMEM-F12 |
| Software Nis Elements Viewer | NIKON | Not applicable | NIS-Elements Viewer is a free standalone program to view image files and datasets |
| Sterile PBS and 2% of P/S solution | LABORCRIN | 590338 | Add 1 mL of P/S in 40 mL of sterile PBS |
| Straight iris scissors | KATENA | Not applicable | Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution |
| Supernatant of L-929 cells | Not applicable | Not applicable | L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF). L-929 supernatant was obtain from the protocol |
| Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel | SWANN-MORTON | 311 | Used for exposing epiphysis from bones |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | GIBCO | 15250061 | Trypan Blue Solution, 0.4%, is routinely used as a cell stain to assess cell viability using the dye exclusion test |
| Trypsin/EDTA solution 0,05% | GIBCO | 25300-062 | Used to dissociate cells from culture bottle |
| Water for Injection (WFI) for Cell Culture | GIBCO | A12873 | Sterile and endotoxin-free water |
References
- Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- van Furth, R., Cohn, Z. A. The origin and kinetics of mononuclear phagocytes. The Journal of Experimental Medicine. 128 (3), 415-435 (1968).
- Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. Macrophage biology in development, homeostasis and disease. Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454 (7203), 428-435 (2008).
- Shapouri-Moghaddam, A., et al. Macrophage plasticity, polarization, and function in health and disease. Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6425-6440 (2018).
- Davies, J. Q., Gordon, S. Isolation and culture of murine macrophages. Methods in Molecular Biology. 290, 91-103 (2005).
- Jin, X., Kruth, H. S. Culture of macrophage colony-stimulating factor differentiated human monocyte-derived macrophages. Journal of Visualized Experiments. (112), e54244 (2016).
- Gonçalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Current Protocols in Immunology. 111 (1), 1-16 (2015).
- Varol, C., Mildner, A., Jung, S. Macrophages: development and tissue specialization. Annual Review of Immunology. 33, 643-675 (2015).
- Andrés, V., Pello, O. M., Silvestre-Roig, C. Macrophage proliferation and apoptosis in atherosclerosis. Current Opinion in Lipidology. 23 (5), 429-438 (2012).
- Pineda-Torra, I., Gage, M., de Juan, A., Pello, O. M. Isolation, culture, and polarization of murine bone marrow-derived and peritoneal macrophages. Methods in Molecular Biology. 1339, 101-109 (2015).
- Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. Journal of Leukocyte Biology. 80 (6), 1298-1307 (2006).
- Hamczyk, M. R., Villa-Bellosta, R., Andrés, V. In vitro macrophage phagocytosis assay. Methods in Molecular Biology. 1339, 235-246 (2015).
- Hosoe, S., et al. Induction of tumoricidal macrophages from bone marrow cells of normal mice or mice bearing a colony-stimulating-factor-producing tumor. Cancer Immunology, Immunotherapy. 28 (2), 116-122 (1989).
- Rice, H. M., et al. rM-CSF efficiently replaces L929 in generating mouse and rat bone marrow-derived macrophages for in vitro functional studies of immunity to intracellular bacteria. Journal of Immunological Methods. 477, 112693 (2020).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Weischenfeldt, J., Porse, B. Bone marrow-derived macrophages (BMM): isolation and applications. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (12), (2008).
- Austin, P. E., Mcculloch, E. A., Till, J. E. Characterization of the factor in L-cell conditioned medium capable of stimulating colony formation by mouse marrow cells in culture. Journal of Cellular Physiology. 77 (2), 121-134 (1971).
- Stanley, E. R. Macrophage colony-stimulating factor (CSF-1). Encyclopedia of Immunology. 116 (1983), 1650-1654 (1998).
- Bou Ghosn, E. E., et al. Two physically, functionally, and developmentally distinct peritoneal macrophage subsets. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (6), 2568-2573 (2010).
- Ray, A., Dittel, B. N. Isolation of mouse peritoneal cavity cells. Journal of Visualized Experiments. (35), e1488 (2010).
