Характеристика нейронального лизосомного интерактома с протеомикой бесконтактной маркировки
Summary
Протокол протеомики по маркировке близости нейронных лизосом описан здесь для характеристики динамического лизосомального микроокружения в индуцированных человеком плюрипотентных нейронах, полученных из стволовых клеток. Лизосомальные мембранные белки и белки, которые взаимодействуют с лизосомами (стабильно или временно), могут быть точно количественно определены в этом методе с отличным внутриклеточным пространственным разрешением в живых нейронах человека.
Abstract
Лизосомы часто общаются с различными биомолекулами для достижения деградации и других разнообразных клеточных функций. Лизосомы имеют решающее значение для функции человеческого мозга, поскольку нейроны являются постмитотическими и в значительной степени зависят от аутофагии-лизосомного пути для поддержания клеточного гомеостаза. Несмотря на достижения в понимании различных лизосомальных функций, захват высокодинамических связей между лизосомами и другими клеточными компонентами является технически сложным, особенно с высокой пропускной способностью. Здесь представлен подробный протокол для недавно опубликованного эндогенного (knock-in) лизосомного бесконтактного мечения протеомным методом в нейронах, полученных из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC).
Как лизосомальные мембранные белки, так и белки, окружающие лизосомы в радиусе 10-20 нм, могут быть уверенно идентифицированы и точно количественно определены в живых нейронах человека. Каждый шаг протокола подробно описан, т.е. культура hiPSC-нейронов, бесконтактная маркировка, сбор нейронов, флуоресцентная микроскопия, обогащение биотинилированного белка, переваривание белка, анализ LC-MS и анализ данных. Таким образом, этот уникальный эндогенный лизосомальный метод бесконтактной маркировки протеомики обеспечивает высокопроизводительный и надежный аналитический инструмент для изучения высокодинамной лизосомальной активности в живых нейронах человека.
Introduction
Лизосомы представляют собой катаболические органеллы, которые разлагают макромолекулы через лизосомально-аутофагический путь1. Помимо деградации, лизосомы участвуют в различных клеточных функциях, таких как сигнальная трансдукция, восприятие питательных веществ и секреция 2,3,4. Возмущения в лизосомальной функции были вовлечены в лизосомальные нарушения хранения, рак, старение и нейродегенерацию 3,5,6,7. Для постмитотических и высокополяризованных нейронов лизосомы играют решающую роль в нейрональном клеточном гомеостазе, высвобождении нейротрансмиттеров и переносе на большие расстояния вдоль аксонов 8,9,10,11. Тем не менее, исследование лизосом в нейронах человека было сложной задачей. Недавние достижения в области технологий нейронов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), позволили культуре живых человеческих нейронов, которые ранее были недоступны, преодолев разрыв между животными моделями и пациентами-людьми для изучения человеческого мозга12,13. В частности, передовая технология i3Neuron стабильно интегрирует фактор транскрипции нейрогенина-2 в геном iPSC под действием промотора, индуцируемого доксициклином, заставляя iPSCs дифференцироваться в чистые корковые нейроны за 2 недели14,15.
Из-за высокодинамической лизосомальной активности захват лизосомальных взаимодействий с другими клеточными компонентами является технически сложным, особенно в высокопроизводительном режиме. Технология бесконтактной маркировки хорошо подходит для изучения этих динамических взаимодействий из-за ее способности захватывать как стабильные, так и переходные/слабые белковые взаимодействия с исключительной пространственной специфичностью16,17. Инженерная пероксидаза или биотинлигаза может быть генетически слита с белком приманки. После активации высокореакционноспособные радикалы биотина продуцируются для ковалентной маркировки соседних белков, которые затем могут быть обогащены шариками, покрытыми стрептавидином, для последующей протеомики снизу вверх с помощью платформ жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS) 17,18,19,20,21.
Недавно был разработан эндогенный лизосомальный метод бесконтактной маркировки протеомики для захвата динамического лизосомального микроокружения в i3нейронах22. Сконструированная аскорбатпероксидаза (APEX2) была введена на С-конец лизосомально-ассоциированного мембранного белка 1 (LAMP1) в иПСК, который затем может быть дифференцирован в корковые нейроны. LAMP1 является обильным лизосомальным мембранным белком и классическим лизосомальным маркером23. LAMP1 также экспрессируется в поздних эндосомах, которые созревают в лизосомы; эти поздние эндосомы-лизосомы и недеградирующие лизосомы упоминаются в этом протоколе как лизосомы. Этот эндогенный зонд LAMP1-APEX, выраженный на физиологическом уровне, может уменьшить артефакты неправильной локализации и сверхэкспрессии LAMP1. Сотни лизосомальных мембранных белков и лизосомальных интеракторов могут быть идентифицированы и количественно определены с отличным пространственным разрешением в живых нейронах человека.
Здесь описан подробный протокол для лизосомной бесконтактной маркировки протеомики в нейронах человека, полученных из iPSC, с дальнейшими улучшениями по сравнению с недавно опубликованным методом22. Общий рабочий процесс показан на рисунке 1. Протокол включает в себя культуру нейронов, полученную из hiPSC, активацию бесконтактной маркировки в нейронах, проверку активности APEX с помощью флуоресцентной микроскопии, определение оптимального соотношения бусин стрептавидина к входному белку, обогащение биотинилированных белков, переваривание белка на шариках, обессоливание и количественное определение пептидов, анализ LC-MS и анализ данных протеомики. Также обсуждаются рекомендации по устранению неполадок и экспериментальные оптимизации для улучшения контроля качества и производительности бесконтактной маркировки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Используя этот зонд LAMP1-APEX, белки на лизосомальной мембране и рядом с ней биотинилируются и обогащаются. Учитывая типичный диаметр лизосомы 100-1 200 нм, этот метод обеспечивает отличное внутриклеточное разрешение с радиусом маркировки 10-20 нм. LAMP1 является обильным лизосомальным мембранны?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование поддерживается грантом NIH (R01NS121608). A.M.F. признает стипендию ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship и стипендию Фонда Бурбона Ф. Скрибнера. Мы благодарим лабораторию Майкла Уорда в Национальном институте неврологических расстройств и инсульта (NINDS) за поддержку молекулярной биологии и разработку технологии i3Neuron.
Materials
| 10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
| Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
| Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
| cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
| DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
| DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
| Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
| Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
| Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
| Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
| Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
| Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
| Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
| Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
| Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
| Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
| SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
| Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
| Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
| Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
| Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
| Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
References
- De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
- Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
- Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
- Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
- Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
- Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
- Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson’s disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
- Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
- Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
- Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
- Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
- Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
- Sunbul, M., Andres, J. . Proximity labeling: Methods and protocols. , (2019).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
- Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
- Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
- Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
- Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
- Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
- Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
- Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
- Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
- Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
- Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
- Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
- kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes – coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
- Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
- Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
- Eskelinen, E. -. L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
- Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
- Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
- Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
- Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).
