近接標識プロテオミクスを用いたニューロンリソソームインタラクトームの特性評価

リソソームは、リソソーム-オートファジー経路¹を介して高分子を分解する異化細胞小器官です。分解に加えて、リソソームはシグナル伝達、栄養感知、分泌などの多様な細胞機能に関与しています^2,3,4。リソソーム機能の摂動は、リソソーム蓄積障害、癌、老化、および神経変性に関与しています3,5,6,7。有糸分裂後および高度に分極したニューロンの場合、リソソームは、ニューロン細胞の恒常性、神経伝達物質の放出、および軸索に沿った長距離輸送において重要な役割を果たします⁸、^9、10、11。しかし、ヒトのニューロンのリソソームを調べることは困難な作業でした。人工多能性幹細胞(iPSC)由来のニューロン技術の最近の進歩により、以前はアクセスできなかった生きたヒトニューロンの培養が可能になり、動物モデルとヒト患者の間のギャップを埋めてヒト脳を研究するようになりました^12,13。特に、高度なi³Neuron技術は、ドキシサイクリン誘導性プロモーターの下で神経ゲニン-2転写因子をiPS細胞ゲノムに安定的に組み込み、iPS細胞を2週間で純粋な皮質ニューロンに分化させる^14,15。

非常に動的なリソソーム活性のため、他の細胞成分とのリソソーム相互作用を捕捉することは、特にハイスループット方式で技術的に困難です。近接標識技術は、並外れた空間特異性で安定したタンパク質相互作用と一過性/弱いタンパク質相互作用の両方を捕捉できるため、これらの動的相互作用の研究に適しています^16,17。操作されたペルオキシダーゼまたはビオチンリガーゼは、ベイトタンパク質に遺伝的に融合することができる。活性化されると、反応性の高いビオチンラジカルが生成され、隣接するタンパク質に共有結合で標識され、液体クロマトグラフィー-質量分析(LC-MS)プラットフォームを介して下流のボトムアッププロテオミクス用のストレプトアビジンコーティングビーズによって濃縮されます¹⁷、¹⁸、¹⁹、^20、21。

内因性リソソーム近接標識プロテオミクス法は、i^3Neurons22の動的リソソーム微小環境を捕捉するために最近開発されました。操作されたアスコルビン酸ペルオキシダーゼ(APEX2)は、iPS細胞のリソソーム関連膜タンパク質1(LAMP1)のC末端にノックインされ、皮質ニューロンに分化することができます。LAMP1は、豊富なリソソーム膜タンパク質であり、古典的なリソソーム^{マーカー23}である。LAMP1は後期エンドソームでも発現し、リソソームに成熟します。これらの後期エンドソームリソソームおよび非分解性リソソームは、すべてこのプロトコルではリソソームと呼ばれる。この内因性LAMP1-APEXプローブは、生理学的レベルで発現し、LAMP1の誤局在および過剰発現アーティファクトを低減することができる。数百のリソソーム膜タンパク質とリソソーム相互作用物質を、生きたヒトニューロンにおいて優れた空間分解能で同定および定量することができます。

ここでは、ヒトiPS細胞由来ニューロンにおけるリソソーム近接標識プロテオミクスのための詳細なプロトコルを、最近公開された方法²²からのさらなる改良を加えて説明する。全体的なワークフローを 図 1 に示します。このプロトコルには、hiPSc由来のニューロン培養、ニューロンにおける近接標識活性化、蛍光顕微鏡によるAPEX活性の検証、最適なストレプトアビジンビーズとインプットタンパク質の比率の決定、ビオチン化タンパク質の濃縮、ビーズ上のタンパク質消化、ペプチドの脱塩と定量、LC-MS分析、およびプロテオミクスデータ分析が含まれます。トラブルシューティングのガイドラインと実験的な最適化についても説明し、近接ラベリングの品質管理とパフォーマンスを向上させます。