Karakterisering van neuronale lysosoom interactoom met proximity labeling proteomics
Summary
Een neuronaal lysosoom proximity labeling proteomics protocol wordt hier beschreven om de dynamische lysosomale micro-omgeving in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide neuronen te karakteriseren. Lysosomale membraaneiwitten en eiwitten die interageren met lysosomen (stabiel of tijdelijk) kunnen nauwkeurig worden gekwantificeerd in deze methode met een uitstekende intracellulaire ruimtelijke resolutie in levende menselijke neuronen.
Abstract
Lysosomen communiceren vaak met een verscheidenheid aan biomoleculen om de afbraak en andere diverse cellulaire functies te bereiken. Lysosomen zijn van cruciaal belang voor de menselijke hersenfunctie, omdat neuronen postmitotisch zijn en sterk afhankelijk zijn van de autofagie-lysosoomroute om cellulaire homeostase te behouden. Ondanks de vooruitgang in het begrip van verschillende lysosomale functies, is het vastleggen van de zeer dynamische communicatie tussen lysosomen en andere cellulaire componenten technisch een uitdaging, vooral op een manier met een hoge doorvoer. Hier wordt een gedetailleerd protocol verstrekt voor de onlangs gepubliceerde endogene (knock-in) lysosoom proximity labeling proteomische methode in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC) afgeleide neuronen.
Zowel lysosomale membraaneiwitten als eiwitten rond lysosomen binnen een straal van 10-20 nm kunnen met vertrouwen worden geïdentificeerd en nauwkeurig worden gekwantificeerd in levende menselijke neuronen. Elke stap van het protocol wordt in detail beschreven, d.w.z. hiPSC-neuroncultuur, nabijheidsetikettering, neuronoogst, fluorescentiemicroscopie, biotinylated eiwitverrijking, eiwitvertering, LC-MS-analyse en gegevensanalyse. Samenvattend biedt deze unieke endogene lysosomale proximity labeling proteomics-methode een high-throughput en robuust analytisch hulpmiddel om de zeer dynamische lysosomale activiteiten in levende menselijke neuronen te bestuderen.
Introduction
Lysosomen zijn katabole organellen die macromoleculen afbreken via de lysosomale-autofagieroute1. Naast afbraak zijn lysosomen betrokken bij diverse cellulaire functies zoals signaaltransductie, nutriëntdetectie en secretie 2,3,4. Verstoringen in de lysosomale functie zijn betrokken bij lysosomale stapelingsstoornissen, kanker, veroudering en neurodegeneratie 3,5,6,7. Voor postmitotische en sterk gepolariseerde neuronen spelen lysosomen een cruciale rol bij neuronale cellulaire homeostase, afgifte van neurotransmitters en transport over lange afstand langs de axonen 8,9,10,11. Het onderzoeken van lysosomen in menselijke neuronen is echter een uitdagende taak geweest. Recente ontwikkelingen in geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC) -afgeleide neurontechnologieën hebben de cultuur van levende menselijke neuronen mogelijk gemaakt die voorheen ontoegankelijk waren, waardoor de kloof tussen diermodellen en menselijke patiënten werd overbrugd om het menselijk brein te bestuderen12,13. Met name de geavanceerde i3Neuron-technologie integreert stabiel de neurogenine-2 transcriptiefactor in het iPSC-genoom onder een doxycycline-induceerbare promotor, waardoor iPSC’s in 2 weken differentiëren in pure corticale neuronen14,15.
Vanwege de zeer dynamische lysosomale activiteit is het vastleggen van lysosomale interacties met andere cellulaire componenten technisch een uitdaging, vooral op een manier met hoge doorvoer. Proximity labeling technologie is zeer geschikt om deze dynamische interacties te bestuderen vanwege het vermogen om zowel stabiele als transiënte / zwakke eiwitinteracties vast te leggen met uitzonderlijke ruimtelijke specificiteit16,17. Gemanipuleerde peroxidase of biotineligase kan genetisch worden gefuseerd met het aaseiwit. Na activering worden zeer reactieve biotineradicalen geproduceerd om naburige eiwitten covalent te labelen, die vervolgens kunnen worden verrijkt met streptavidin-gecoate kralen voor downstream bottom-up proteomics via vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) platforms 17,18,19,20,21.
Een endogene lysosomale proximity labeling proteomics methode werd onlangs ontwikkeld om de dynamische lysosomale micro-omgeving vast te leggen in i3Neuronen22. Engineered ascorbate peroxidase (APEX2) werd ingeslagen op de C-terminus van het lysosomale geassocieerde membraaneiwit 1 (LAMP1) in iPSC’s, dat vervolgens kan worden gedifferentieerd in corticale neuronen. LAMP1 is een overvloedig lysosomaal membraaneiwit en een klassieke lysosomale marker23. LAMP1 komt ook tot expressie in late endosomen, die uitgroeien tot lysosomen; deze late endosoom-lysosomen en niet-afbrekende lysosomen worden in dit protocol allemaal lysosomen genoemd. Deze endogene LAMP1-APEX-sonde, uitgedrukt op fysiologisch niveau, kan LAMP1-mislokalisatie en overexpressieartefacten verminderen. Honderden lysosomale membraaneiwitten en lysosomale interactoren kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd met een uitstekende ruimtelijke resolutie in levende menselijke neuronen.
Hier wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor lysosoomtoetredingsetikettering van proteomics in menselijke iPSC-afgeleide neuronen met verdere verbeteringen ten opzichte van de onlangs gepubliceerde methode22. De algemene workflow wordt geïllustreerd in figuur 1. Het protocol omvat hiPSC-afgeleide neuroncultuur, nabijheidsetiketteringsactivering in neuronen, validatie van APEX-activiteit door fluorescentiemicroscopie, bepaling van een optimale streptavidin-kralen-tot-input-eiwitverhouding, verrijking van gebiotinyleerde eiwitten, eiwitvertering op kralen, peptide-ontzilting en kwantificering, LC-MS-analyse en proteomics-gegevensanalyse. Richtlijnen voor probleemoplossing en experimentele optimalisaties worden ook besproken om de kwaliteitscontrole en prestaties van proximity labeling te verbeteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met behulp van deze LAMP1-APEX-sonde worden eiwitten op en nabij het lysosomale membraan gebiotinyleerd en verrijkt. Gezien de typische lysosoomdiameter van 100-1.200 nm, biedt deze methode een uitstekende intracellulaire resolutie met een labelstraal van 10-20 nm. LAMP1 is een overvloedig lysosomaal membraaneiwit en een klassieke marker voor lysosomen, die dient als een uitstekend aaseiwit voor lysosomale APEX-etikettering op het endogene expressieniveau. Er zijn echter ook beperkingen bij het gebruik van LAMP1 om lysos…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie wordt ondersteund door de NIH-subsidie (R01NS121608). A.M.F. erkent de ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship en de Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. We bedanken het Michael Ward-lab van het National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) voor de ondersteuning van moleculaire biologie en de ontwikkeling van de i3Neuron-technologie.
Materials
| 10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
| Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
| Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
| cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
| DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
| DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
| Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
| Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
| Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
| Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
| Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
| Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
| Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
| Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
| Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
| Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
| SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
| Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
| Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
| Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
| Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
| Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
References
- De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
- Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
- Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
- Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
- Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
- Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
- Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson’s disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
- Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
- Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
- Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
- Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
- Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
- Sunbul, M., Andres, J. . Proximity labeling: Methods and protocols. , (2019).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
- Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
- Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
- Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
- Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
- Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
- Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
- Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
- Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
- Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
- Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
- Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
- kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes – coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
- Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
- Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
- Eskelinen, E. -. L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
- Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
- Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
- Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
- Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).
