Charakterisierung des neuronalen Lysosomen-Interaktoms mit Proximity-Markierungsproteomik
Summary
Ein neuronales Lysosomen-Proximity-Markierungs-Proteomik-Protokoll wird hier beschrieben, um die dynamische lysosomale Mikroumgebung in humanen induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Neuronen zu charakterisieren. Lysosomale Membranproteine und Proteine, die mit Lysosomen interagieren (stabil oder vorübergehend), können in dieser Methode mit hervorragender intrazellulärer räumlicher Auflösung in lebenden menschlichen Neuronen genau quantifiziert werden.
Abstract
Lysosomen kommunizieren häufig mit einer Vielzahl von Biomolekülen, um den Abbau und andere verschiedene zelluläre Funktionen zu erreichen. Lysosomen sind entscheidend für die menschliche Gehirnfunktion, da Neuronen postmitotisch sind und stark auf den Autophagie-Lysosomen-Weg angewiesen sind, um die zelluläre Homöostase aufrechtzuerhalten. Trotz Fortschritten im Verständnis verschiedener lysosomaler Funktionen ist die Erfassung der hochdynamischen Kommunikation zwischen Lysosomen und anderen zellulären Komponenten technisch schwierig, insbesondere im Hochdurchsatz. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die kürzlich veröffentlichte endogene (knock-in) Lysosomen-Proximity-Markierungsmethode in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSC)-abgeleiteten Neuronen bereitgestellt.
Sowohl lysosomale Membranproteine als auch Proteine, die Lysosomen in einem Umkreis von 10-20 nm umgeben, können in lebenden menschlichen Neuronen sicher identifiziert und genau quantifiziert werden. Jeder Schritt des Protokolls wird detailliert beschrieben, d.h. hiPSC-Neuronenkultur, Proximity-Markierung, Neuronenernte, Fluoreszenzmikroskopie, biotinylierte Proteinanreicherung, Proteinverdauung, LC-MS-Analyse und Datenanalyse. Zusammenfassend bietet diese einzigartige endogene lysosomale Proximity-Markierungsmethode ein robustes Analysewerkzeug mit hohem Durchsatz, um die hochdynamischen lysosomalen Aktivitäten in lebenden menschlichen Neuronen zu untersuchen.
Introduction
Lysosomen sind katabole Organellen, die Makromoleküle über den lysosomalen Autophagieweg1 abbauen. Neben dem Abbau sind Lysosomen an verschiedenen zellulären Funktionen wie Signaltransduktion, Nährstofferkennung und Sekretion beteiligt 2,3,4. Störungen der lysosomalen Funktion wurden mit lysosomalen Speicherstörungen, Krebs, Alterung und Neurodegeneration in Verbindung gebracht 3,5,6,7. Für postmitotische und stark polarisierte Neuronen spielen Lysosomen eine entscheidende Rolle bei der neuronalen zellulären Homöostase, der Freisetzung von Neurotransmittern und dem Ferntransport entlang der Axone 8,9,10,11. Die Untersuchung von Lysosomen in menschlichen Neuronen war jedoch eine herausfordernde Aufgabe. Jüngste Fortschritte bei induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC)-abgeleiteten Neuronentechnologien haben die Kultur lebender menschlicher Neuronen ermöglicht, die zuvor unzugänglich waren, und die Lücke zwischen Tiermodellen und menschlichen Patienten überbrückt, um das menschliche Gehirn zu untersuchen12,13. Insbesondere integriert die fortschrittliche i3Neuron-Technologie stabil den Neurogenin-2-Transkriptionsfaktor in das iPSC-Genom unter einem Doxycyclin-induzierbaren Promotor, wodurch iPSCs dazu gebracht werden, sich in 2 Wochen in reine kortikale Neuronen zu differenzieren14,15.
Aufgrund der hochdynamischen lysosomalen Aktivität ist die Erfassung lysosomaler Interaktionen mit anderen zellulären Komponenten technisch anspruchsvoll, insbesondere im Hochdurchsatz. Die Proximity-Markierungstechnologie eignet sich gut zur Untersuchung dieser dynamischen Wechselwirkungen, da sie sowohl stabile als auch transiente/schwache Proteininteraktionen mit außergewöhnlicher räumlicher Spezifität erfassen kann16,17. Technisch hergestellte Peroxidase oder Biotinligase können genetisch mit dem Köderprotein verschmolzen werden. Nach der Aktivierung werden hochreaktive Biotinradikale erzeugt, um benachbarte Proteine kovalent zu markieren, die dann durch Streptavidin-beschichtete Beads für die nachgeschaltete Bottom-up-Proteomik über flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Plattformen (LC-MS) 17,18,19,20,21 angereichert werden können.
Eine endogene lysosomale Proximity-Markierungsmethode wurde kürzlich entwickelt, um die dynamische lysosomale Mikroumgebung in i3Neuronen22 zu erfassen. Die technisch hergestellte Ascorbatperoxidase (APEX2) wurde auf den C-Terminus des lysosomal assoziierten Membranproteins 1 (LAMP1) in iPSCs eingeschlagen, die dann in kortikale Neuronen differenziert werden können. LAMP1 ist ein reichlich vorhandenes lysosomales Membranprotein und ein klassischer lysosomaler Marker23. LAMP1 wird auch in späten Endosomen exprimiert, die zu Lysosomen reifen; Diese späten Endosomen-Lysosomen und nicht-degradativen Lysosomen werden in diesem Protokoll alle als Lysosomen bezeichnet. Diese endogene LAMP1-APEX-Sonde, die auf physiologischer Ebene exprimiert wird, kann LAMP1-Fehllokalisations- und Überexpressionsartefakte reduzieren. Hunderte von lysosomalen Membranproteinen und lysosomalen Interaktoren können mit hervorragender räumlicher Auflösung in lebenden menschlichen Neuronen identifiziert und quantifiziert werden.
Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Lysosomen-Proximity-Markierungsproteomik in humanen iPSC-abgeleiteten Neuronen mit weiteren Verbesserungen der kürzlich veröffentlichten Methode22 beschrieben. Der gesamte Workflow ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Protokoll umfasst die hiPSC-abgeleitete Neuronenkultur, die Aktivierung der Proximity-Markierung in Neuronen, die Validierung der APEX-Aktivität durch Fluoreszenzmikroskopie, die Bestimmung eines optimalen Verhältnisses von Streptavidin-Perlen zu Eingangsproteinen, die Anreicherung biotinylierter Proteine, die Proteinverdauung auf Perlen, die Entsalzung und Quantifizierung von Peptiden, die LC-MS-Analyse und die Analyse von Proteomik-Daten. Richtlinien zur Fehlerbehebung und experimentelle Optimierungen werden ebenfalls diskutiert, um die Qualitätskontrolle und Leistung der Proximity-Kennzeichnung zu verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mit dieser LAMP1-APEX-Sonde werden Proteine auf und in der Nähe der lysosomalen Membran biotinyliert und angereichert. Angesichts des typischen Lysosomendurchmessers von 100-1.200 nm bietet diese Methode eine hervorragende intrazelluläre Auflösung mit einem Markierungsradius von 10-20 nm. LAMP1 ist ein reichlich vorhandenes lysosomales Membranprotein und ein klassischer Marker für Lysosomen, der als hervorragendes Köderprotein für die lysosomale APEX-Markierung auf endogener Expressionsebene dient. Einschränkungen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wird durch den NIH-Zuschuss (R01NS121608) unterstützt. A.M.F. dankt dem ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship und dem Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Wir danken dem Michael Ward Labor am National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) für die molekularbiologische Unterstützung und die Entwicklung der i3Neuron-Technologie.
Materials
| 10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
| Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
| Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
| cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
| DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
| DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
| Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
| Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
| Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
| Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
| Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
| Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
| Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
| Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
| Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
| Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
| SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
| Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
| Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
| Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
| Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
| Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
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