אפיון של אינטראקטום ליזוזום עצבי עם פרוטאומיקה לתיוג קרבה
Summary
פרוטוקול פרוטאומיקה של ליזוזום עצבי המתייג קרבה מתואר כאן כדי לאפיין את המיקרו-סביבה הליזוזומלית הדינמית בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם. חלבוני קרום ליזוזומליים וחלבונים המקיימים אינטראקציה עם ליזוזומים (ביציבות או בחולף) ניתנים לכימות מדויק בשיטה זו עם רזולוציה מרחבית תוך תאית מצוינת בנוירונים אנושיים חיים.
Abstract
ליזוזומים מתקשרים לעתים קרובות עם מגוון של ביומולקולות כדי להשיג את הפירוק ותפקודים תאיים מגוונים אחרים. ליזוזומים הם קריטיים לתפקוד המוח האנושי, מכיוון שתאי עצב הם פוסט-מיטוטיים ומסתמכים במידה רבה על מסלול האוטופגיה-ליזוזום כדי לשמור על הומאוסטזיס תאי. למרות ההתקדמות בהבנה של פונקציות ליזוזומליות שונות, לכידת התקשורת הדינמית ביותר בין ליזוזומים לרכיבים תאיים אחרים היא מאתגרת מבחינה טכנית, במיוחד באופן בעל תפוקה גבוהה. כאן, פרוטוקול מפורט מסופק עבור השיטה האנדוגנית (knock-in) ליזוזום קרבה תיוג פרוטאומית שפורסמה לאחרונה בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC).
הן חלבוני ממברנה ליזוזומליים והן חלבונים המקיפים ליזוזומים ברדיוס של 10-20 ננומטר ניתנים לזיהוי בטוח ולכימות מדויק בנוירונים אנושיים חיים. כל שלב בפרוטוקול מתואר בפירוט, כלומר, תרבית נוירונים hiPSC, תיוג קרבה, קציר נוירונים, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, העשרת חלבונים ביוטינילציה, עיכול חלבונים, ניתוח LC-MS וניתוח נתונים. לסיכום, שיטה ייחודית זו לתיוג קרבה ליזוסומלית אנדוגנית מספקת תפוקה גבוהה וכלי אנליטי חזק לחקר הפעילויות הליזוזומיות הדינמיות ביותר בנוירונים אנושיים חיים.
Introduction
ליזוזומים הם אברונים קטבוליים המפרקים מקרומולקולות דרך המסלול הליזוזומלי-אוטופגיה1. מלבד השפלה, ליזוזומים מעורבים במגוון תפקודים תאיים כגון התמרת איתותים, חישת חומרים מזינים והפרשת 2,3,4. הפרעות בתפקוד הליזוזומלי היו מעורבות בהפרעות אחסון ליזוזומליות, סרטן, הזדקנות וניוון עצבי 3,5,6,7. עבור נוירונים פוסטמיטוטיים ומקוטבים מאוד, ליזוזומים ממלאים תפקידים קריטיים בהומאוסטזיס תאי עצבי, שחרור מוליכים עצביים והובלה למרחקים ארוכים לאורך האקסונים 8,9,10,11. עם זאת, חקירת ליזוזומים בתאי עצב אנושיים הייתה משימה מאתגרת. ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות נוירונים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) אפשרה לתרבית של נוירונים אנושיים חיים שלא היו נגישים בעבר, וגישור על הפער בין מודלים של בעלי חיים לבין מטופלים אנושיים לחקור את המוח האנושי12,13. במיוחד, טכנולוגיית i3Neuron המתקדמת משלבת ביציבות את גורם השעתוק של נוירוגנין-2 לתוך הגנום של iPSC תחת מקדם דוקסיציקלין-אינדוקלין, מה שמניע iPSCs להתמיין לנוירונים קליפתיים טהורים תוך שבועיים14,15.
בשל הפעילות הליזוזומלית הדינמית ביותר, לכידת אינטראקציות ליזוזומליות עם רכיבים תאיים אחרים היא מאתגרת מבחינה טכנית, במיוחד באופן בעל תפוקה גבוהה. טכנולוגיית תיוג קרבה מתאימה היטב לחקר אינטראקציות דינמיות אלה בגלל יכולתה ללכוד אינטראקציות חלבון יציבות וחולפות/חלשות עם ספציפיות מרחבית יוצאת דופן16,17. פרוקסידאז מהונדס או ביוטין ליגאז יכולים להתמזג גנטית עם חלבון הפיתיון. לאחר ההפעלה, רדיקלים ביוטינים תגובתיים מאוד מיוצרים כדי לתייג באופן קוולנטי חלבונים שכנים, אשר לאחר מכן ניתן להעשיר אותם על ידי חרוזים מצופים סטרפטווידין עבור פרוטאומיקה מלמטה למעלה במורד הזרם באמצעות פלטפורמות ספקטרומטריית מסות כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS) 17,18,19,20,21.
לאחרונה פותחה שיטה אנדוגנית לתיוג פרוטאומיקה של קרבה ליזוסומלית כדי ללכוד את המיקרו-סביבה הליזוזומלית הדינמית ב-i3Neurons22. אסקורבט פרוקסידאז מהונדס (APEX2) הוכנס ל-C-terminus של חלבון הממברנה הליזוזומלי הקשור ל-1 (LAMP1) ב-iPSCs, אשר לאחר מכן ניתן להבדיל אותם לנוירונים בקליפת המוח. LAMP1 הוא חלבון ממברנה ליזוזומלי בשפע וסמן ליזוזומלי קלאסי23. LAMP1 מתבטא גם באנדוזומים מאוחרים, המבשילים לליזוזומים; אנדוזומים-ליזוזומים מאוחרים אלה וליזוזומים לא מתכלים מכונים כולם ליזוזומים בפרוטוקול זה. בדיקה אנדוגנית זו של LAMP1-APEX, המתבטאת ברמה הפיזיולוגית, יכולה להפחית את המיסלוקליזציה של LAMP1 ואת ממצאי ביטוי היתר. ניתן לזהות ולכמת מאות חלבוני ממברנה ליזוזומליים ואינטראקטורים ליזוזומליים ברזולוציה מרחבית מצוינת בתאי עצב אנושיים חיים.
כאן, פרוטוקול מפורט לתיוג קרבה ליזוזומית פרוטאומיקה בנוירונים שמקורם ב- iPSC אנושי מתואר עם שיפורים נוספים משיטה22 שפורסמה לאחרונה. זרימת העבודה הכוללת מתוארת באיור 1. הפרוטוקול כולל תרבית נוירונים שמקורה ב-hiPSC, הפעלת תיוג קרבה בתאי עצב, אימות פעילות APEX על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, קביעת יחס אופטימלי בין חלבון חרוזים לקלט של סטרפטאווידין, העשרה של חלבונים שעברו ביוטינילציה, עיכול חלבונים על חרוזים, התפלה וכימות פפטידים, ניתוח LC-MS וניתוח נתוני פרוטאומיקה. הנחיות לפתרון בעיות ואופטימיזציות ניסיוניות נדונות גם כדי לשפר את בקרת האיכות והביצועים של תיוג קרבה.
Protocol
Representative Results
Discussion
באמצעות בדיקה זו של LAMP1-APEX, חלבונים על הממברנה הליזוזומלית ובסמוך לה עוברים ביוטינילציה ומועשרים. בהתחשב בקוטר הליזוזום הטיפוסי של 100-1,200 ננומטר, שיטה זו מספקת רזולוציה תוך-תאית מצוינת עם רדיוס תיוג של 10-20 ננומטר. LAMP1 הוא חלבון ממברנה ליזוזומלי בשפע וסמן קלאסי לליזוזומים, המשמש כחלבון פיתיו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענק NIH (R01NS121608). A.M.F. מכיר במלגת פרק ARCS-Metro Washington ובמלגת קרן בורבון פ. סקריבנר. אנו מודים למעבדת מייקל וורד במכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (NINDS) על התמיכה בביולוגיה מולקולרית ולפיתוח טכנולוגיית i3Neuron.
Materials
| 10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
| Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
| Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
| cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
| DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
| DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
| Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
| Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
| Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
| Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
| Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
| Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
| Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
| Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
| Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
| Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
| SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
| Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
| Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
| Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
| Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
| Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
References
- De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
- Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
- Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
- Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
- Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
- Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
- Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson’s disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
- Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
- Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
- Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
- Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
- Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
- Sunbul, M., Andres, J. . Proximity labeling: Methods and protocols. , (2019).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
- Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
- Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
- Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
- Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
- Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
- Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
- Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
- Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
- Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
- Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
- Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
- kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes – coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
- Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
- Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
- Eskelinen, E. -. L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
- Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
- Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
- Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
- Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).
