توصيف تفاعل الليزوزوم العصبي مع البروتينات ذات العلامات القريبة
Summary
يوصف هنا بروتوكول البروتينات التوأم للجسيمات العصبية الليزوزومية لتوصيف البيئة المكروية الليزوزومية الديناميكية في الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان. يمكن قياس بروتينات الغشاء الليزوزومي والبروتينات التي تتفاعل مع الليزوزومات (بشكل ثابت أو عابر) بدقة في هذه الطريقة بدقة مكانية ممتازة داخل الخلايا في الخلايا العصبية البشرية الحية.
Abstract
تتواصل الليزوزومات في كثير من الأحيان مع مجموعة متنوعة من الجزيئات الحيوية لتحقيق التدهور والوظائف الخلوية المتنوعة الأخرى. تعد الجسيمات الحالة ضرورية لوظيفة الدماغ البشري؛ حيث تكون الخلايا العصبية بعد الانقسام وتعتمد بشكل كبير على مسار الالتهام الذاتي والليزوزوم للحفاظ على الاتزان الخلوي. على الرغم من التقدم في فهم وظائف الليزوزومات المختلفة ، فإن التقاط الاتصالات الديناميكية للغاية بين الجسيمات الحالة والمكونات الخلوية الأخرى يمثل تحديا تقنيا ، لا سيما بطريقة عالية الإنتاجية. هنا ، يتم توفير بروتوكول مفصل لطريقة وسم القرب من الليزوزومات الداخلية (الضربة القاضية) المنشورة مؤخرا في الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بشريا (hiPSC).
يمكن تحديد كل من بروتينات الغشاء الليزوزومي والبروتينات المحيطة بالليزوزومات داخل دائرة نصف قطرها 10-20 نانومتر بثقة وقياسها بدقة في الخلايا العصبية البشرية الحية. يتم وصف كل خطوة من خطوات البروتوكول بالتفصيل ، أي ثقافة الخلايا العصبية hiPSC ، ووضع العلامات على القرب ، وحصاد الخلايا العصبية ، والفحص المجهري الفلوري ، وإثراء البروتين البيوتيني ، وهضم البروتين ، وتحليل LC-MS ، وتحليل البيانات. باختصار ، توفر طريقة البروتينات الفريدة لوضع العلامات على القرب من الليزوزومات الداخلية أداة تحليلية عالية الإنتاجية وقوية لدراسة الأنشطة الليزوزومية الديناميكية للغاية في الخلايا العصبية البشرية الحية.
Introduction
الجسيمات الحالة هي عضيات تقويضية تحلل الجزيئات الكبيرة عبر مسار الالتهام الذاتي الليزوزومي1. إلى جانب التدهور ، تشارك الليزوزومات في وظائف خلوية متنوعة مثل نقل الإشارات واستشعار المغذيات والإفراز2،3،4. تورطت الاضطرابات في وظيفة الليزوزومات في اضطرابات التخزين الليزوزومية والسرطان والشيخوخة والتنكس العصبي3،5،6،7. بالنسبة للخلايا العصبية بعد الانقسام وشديدة الاستقطاب ، تلعب الليزوزومات أدوارا مهمة في الاتزان الخلوي العصبي ، وإطلاق الناقل العصبي ، والنقل لمسافات طويلة على طول المحاور8،9،10،11. ومع ذلك ، فإن التحقيق في الجسيمات الحالة في الخلايا العصبية البشرية كان مهمة صعبة. مكنت التطورات الحديثة في تقنيات الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSC) من زراعة الخلايا العصبية البشرية الحية التي لم يكن من الممكن الوصول إليها في السابق ، مما أدى إلى سد الفجوة بين النماذج الحيوانية والمرضى من البشر لدراسة الدماغ البشري12,13. على وجه الخصوص ، تدمج تقنية i3Neuron المتقدمة بثبات عامل النسخ neurogenin-2 في جينوم iPSC تحت مروج محفز للدوكسيسيكلين ، مما يدفع iPSCs إلى التمايز إلى خلايا عصبية قشرية نقية في أسبوعين14,15.
نظرا للنشاط الليزوزومي الديناميكي للغاية ، فإن التقاط التفاعلات الليزوزومية مع المكونات الخلوية الأخرى يمثل تحديا تقنيا ، لا سيما بطريقة عالية الإنتاجية. تقنية وضع العلامات عن قرب مناسبة تماما لدراسة هذه التفاعلات الديناميكية نظرا لقدرتها على التقاط تفاعلات البروتين المستقرة والعابرة / الضعيفة مع خصوصية مكانية استثنائية16,17. يمكن دمج البيروكسيديز المهندسون أو البيوتين ليجاز وراثيا مع بروتين الطعم. عند التنشيط ، يتم إنتاج جذور البيوتين عالية التفاعل لتسمية البروتينات المجاورة تساهميا ، والتي يمكن بعد ذلك تخصيبها بالخرز المطلي بالستربتافيدين للبروتينات من أسفل إلى أعلى عبر منصات قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS)17،18،19،20،21.
تم مؤخرا تطوير طريقة البروتينات لوضع العلامات على القرب من الليزوزومات الذاتية لالتقاط البيئة المكروية الليزوزومية الديناميكية في i3Neurons22. تم ضرب بيروكسيديز الأسكوربات الهندسي (APEX2) على المحطة C لبروتين الغشاء المرتبط بالليزوزومات 1 (LAMP1) في iPSCs ، والتي يمكن بعد ذلك تمييزها إلى خلايا عصبية قشرية. LAMP1 هو بروتين غشاء ليزوزومي وفير وعلامة ليزوزومية كلاسيكية23. يتم التعبير عن LAMP1 أيضا في الإندوسومات المتأخرة ، والتي تنضج إلى الليزوزومات. يشار إلى كل من هذه الليزوزومات اللينزوزومية المتأخرة والليزوزومات غير المتدهورة باسم الليزوزومات في هذا البروتوكول. يمكن لمسبار LAMP1-APEX الداخلي ، الذي يتم التعبير عنه على المستوى الفسيولوجي ، أن يقلل من سوء تحديد موقع LAMP1 والتحف المفرطة في التعبير. يمكن تحديد المئات من بروتينات الغشاء الليزوزومي والمتفاعلات الليزوزومية وقياسها بدقة مكانية ممتازة في الخلايا العصبية البشرية الحية.
هنا ، يتم وصف بروتوكول مفصل لبروتينات وسم القرب من الليزوزوم في الخلايا العصبية المشتقة من iPSC البشرية مع مزيد من التحسينات من الطريقة22 المنشورة مؤخرا. يوضح الشكل 1 سير العمل العام. يتضمن البروتوكول زراعة الخلايا العصبية المشتقة من hiPSC ، وتنشيط وضع العلامات عن قرب في الخلايا العصبية ، والتحقق من نشاط APEX عن طريق الفحص المجهري الفلوري ، وتحديد نسبة البروتين المثلى من حبات الستربتافيدين إلى المدخلات ، وإثراء البروتينات البيوتينيل ، وهضم البروتين على الخرز ، وتحلية الببتيد وتحديدها ، وتحليل LC-MS ، وتحليل بيانات البروتينات. تتم أيضا مناقشة إرشادات استكشاف الأخطاء وإصلاحها والتحسينات التجريبية لتحسين مراقبة جودة وأداء وضع العلامات القريبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
باستخدام مسبار LAMP1-APEX هذا ، يتم إثراء البروتينات الموجودة على الغشاء الليزوزومي وبالقرب منه. بالنظر إلى قطر الليزوزوم النموذجي من 100-1200 نانومتر ، توفر هذه الطريقة دقة ممتازة داخل الخلايا مع نصف قطر وضع العلامات 10-20 نانومتر. LAMP1 هو بروتين غشاء ليزوزومي وفير وعلامة كلاسيكية للليزوزومات ، ويع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذه الدراسة مدعومة بمنحة المعاهد الوطنية للصحة (R01NS121608). تعترف AMF بمنحة ARCS-Metro Washington Chapter الدراسية وزمالة Bourbon F. Scribner Endowment. نشكر مختبر مايكل وارد في المعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) على دعم البيولوجيا الجزيئية وتطوير تقنية i3Neuron.
Materials
| 10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
| Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
| Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
| cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
| DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
| DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
| Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
| Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
| Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
| Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
| Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
| Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
| Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
| Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
| Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
| Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
| SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
| Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
| Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
| Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
| Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
| Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
References
- De Duve, C., Wattiaux, R. Functions of lysosomes. Annual Review of Physiology. 28 (1), 435-492 (1966).
- Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
- Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
- Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P. The proteome of lysosomes. Proteomics. 10 (22), 4053-4076 (2010).
- Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
- Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
- Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson’s disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
- Ferguson, S. M. Neuronal lysosomes. Neuroscience Letters. 697, 1-9 (2019).
- Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
- Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
- Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
- Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
- Sunbul, M., Andres, J. . Proximity labeling: Methods and protocols. , (2019).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
- Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
- Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
- Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
- Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
- Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
- Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
- Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
- Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
- Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
- Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
- Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
- kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes – coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
- Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
- Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
- Eskelinen, E. -. L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
- Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
- Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
- Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology – Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
- Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).
