Caratterizzazione dell'interattoma del lisosoma neuronale con proteomica di marcatura di prossimità
Summary
Un protocollo di proteomica di marcatura di prossimità del lisosoma neuronale è descritto qui per caratterizzare il microambiente lisosomiale dinamico nei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall’uomo. Le proteine lisosomiali di membrana e le proteine che interagiscono con i lisosomi (stabilmente o transitoriamente) possono essere quantificate con precisione in questo metodo con un’eccellente risoluzione spaziale intracellulare nei neuroni umani vivi.
Abstract
I lisosomi comunicano frequentemente con una varietà di biomolecole per ottenere la degradazione e altre diverse funzioni cellulari. I lisosomi sono fondamentali per la funzione cerebrale umana, poiché i neuroni sono postmitotici e dipendono fortemente dalla via autofagia-lisosoma per mantenere l’omeostasi cellulare. Nonostante i progressi nella comprensione delle varie funzioni lisosomiali, catturare le comunicazioni altamente dinamiche tra i lisosomi e altri componenti cellulari è tecnicamente impegnativo, in particolare in modo ad alto rendimento. Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per il metodo proteomico di marcatura di prossimità del lisosoma endogeno (knock-in) recentemente pubblicato nei neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC).
Sia le proteine della membrana lisosomiale che le proteine che circondano i lisosomi entro un raggio di 10-20 nm possono essere identificate con sicurezza e quantificate con precisione nei neuroni umani vivi. Ogni fase del protocollo è descritta in dettaglio, cioè coltura di neuroni hiPSC, etichettatura di prossimità, raccolta di neuroni, microscopia a fluorescenza, arricchimento proteico biotinilato, digestione proteica, analisi LC-MS e analisi dei dati. In sintesi, questo esclusivo metodo di proteomica di marcatura di prossimità lisosomiale endogena fornisce uno strumento analitico robusto e ad alto rendimento per studiare le attività lisosomiali altamente dinamiche nei neuroni umani vivi.
Introduction
I lisosomi sono organelli catabolici che degradano le macromolecole attraverso la via lisosomiale-autofagica1. Oltre alla degradazione, i lisosomi sono coinvolti in diverse funzioni cellulari come la trasduzione della segnalazione, il rilevamento dei nutrienti e la secrezione 2,3,4. Perturbazioni nella funzione lisosomiale sono state implicate nei disturbi da accumulo lisosomiale, nel cancro, nell’invecchiamento e nella neurodegenerazione 3,5,6,7. Per i neuroni postmitotici e altamente polarizzati, i lisosomi svolgono un ruolo critico nell’omeostasi cellulare neuronale, nel rilascio di neurotrasmettitori e nel trasporto a lunga distanza lungo gli assoni 8,9,10,11. Tuttavia, studiare i lisosomi nei neuroni umani è stato un compito impegnativo. I recenti progressi nelle tecnologie dei neuroni derivati dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) hanno permesso alla coltura di neuroni umani vivi che in precedenza erano inaccessibili, colmando il divario tra modelli animali e pazienti umani per studiare il cervello umano12,13. In particolare, l’avanzata tecnologia i3Neuron integra stabilmente il fattore di trascrizione della neurogenina-2 nel genoma iPSC sotto un promotore inducibile dalla doxiciclina, spingendo le iPSC a differenziarsi in neuroni corticali puri in 2 settimane14,15.
A causa dell’attività lisosomiale altamente dinamica, catturare le interazioni lisosomiali con altri componenti cellulari è tecnicamente impegnativo, in particolare in modo ad alto rendimento. La tecnologia di etichettatura di prossimità è adatta allo studio di queste interazioni dinamiche grazie alla sua capacità di catturare interazioni proteiche sia stabili che transitorie/deboli con un’eccezionale specificità spaziale16,17. La perossidasi ingegnerizzata o la biotina ligasi possono essere geneticamente fuse alla proteina esca. Al momento dell’attivazione, vengono prodotti radicali biotinici altamente reattivi per marcare covalentemente le proteine vicine, che possono quindi essere arricchite da perle rivestite di streptavidina per la proteomica bottom-up a valle tramite piattaforme di cromatografia liquida-spettrometria di massa (LC-MS) 17,18,19,20,21.
Un metodo endogeno di proteomica di marcatura di prossimità lisosomiale è stato recentemente sviluppato per catturare il microambiente lisosomiale dinamico in i3Neuroni22. L’ascorbato perossidasi ingegnerizzata (APEX2) è stata inserita sul C-terminale della proteina di membrana associata lisosomiale 1 (LAMP1) nelle iPSC, che possono quindi essere differenziate in neuroni corticali. LAMP1 è un’abbondante proteina di membrana lisosomiale e un marcatore lisosomiale classico23. LAMP1 è espresso anche negli endosomi tardivi, che maturano in lisosomi; Questi endosomi-lisosomi tardivi e lisosomi non degradativi sono tutti indicati come lisosomi in questo protocollo. Questa sonda endogena LAMP1-APEX, espressa a livello fisiologico, può ridurre la localizzazione errata di LAMP1 e gli artefatti di sovraespressione. Centinaia di proteine di membrana lisosomiale e interattori lisosomiali possono essere identificati e quantificati con un’eccellente risoluzione spaziale in neuroni umani vivi.
Qui, un protocollo dettagliato per la proteomica della marcatura di prossimità del lisosoma nei neuroni umani derivati da iPSC è descritto con ulteriori miglioramenti rispetto al metodo22 recentemente pubblicato. Il flusso di lavoro complessivo è illustrato nella Figura 1. Il protocollo include la coltura di neuroni derivati dall’hiPSC, l’attivazione dell’etichettatura di prossimità nei neuroni, la convalida dell’attività APEX mediante microscopia a fluorescenza, la determinazione di un rapporto ottimale tra perline di streptavidina e proteina di input, l’arricchimento di proteine biotinilate, la digestione delle proteine on-beads, la desalinizzazione e la quantificazione dei peptidi, l’analisi LC-MS e l’analisi dei dati proteomici. Vengono inoltre discusse le linee guida per la risoluzione dei problemi e le ottimizzazioni sperimentali per migliorare il controllo della qualità e le prestazioni dell’etichettatura di prossimità.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilizzando questa sonda LAMP1-APEX, le proteine sopra e vicino alla membrana lisosomiale sono biotinilate e arricchite. Dato il tipico diametro del lisosoma di 100-1.200 nm, questo metodo fornisce un’eccellente risoluzione intracellulare con un raggio di marcatura di 10-20 nm. LAMP1 è un’abbondante proteina di membrana lisosomiale e un marker classico per i lisosomi, che funge da eccellente proteina esca per la marcatura lisosomiale APEX a livello di espressione endogena. Tuttavia, esistono limitazioni anche quando si …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è supportato dalla sovvenzione NIH (R01NS121608). A.M.F. riconosce la borsa di studio ARCS-Metro Washington Chapter e la Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Ringraziamo il laboratorio Michael Ward presso il National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) per il supporto alla biologia molecolare e lo sviluppo della tecnologia i3Neuron.
Materials
| 10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
| Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
| Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
| cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
| DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
| DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
| Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
| Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
| Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
| Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
| Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
| Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
| Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
| Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
| Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
| Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
| SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
| Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
| Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
| Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
| Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
| Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
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