Un robusto flusso di lavoro di elaborazione crioelettronica a particella singola (cryo-EM) con crioSPARC, RELION e Scipion

La microscopia crioelettronica (cryo-EM) e l’analisi a singola particella (SPA) consentono la determinazione della struttura di un’ampia varietà di assemblaggi biomolecolari nel loro stato idratato, contribuendo a illuminare i ruoli di queste macromolecole nei dettagli atomici. I miglioramenti nell’ottica del microscopio, nell’hardware del computer e nel software di elaborazione delle immagini hanno permesso di determinare le strutture delle biomolecole con una risoluzione superiore a 2 ^Å1,2,3. Più di 2.300 strutture crio-EM sono state depositate nella Protein Data Bank (PDB) nel 2020, rispetto alle 192 strutture del 20144, indicando che la crio-EM è diventata il metodo di scelta per molti biologi strutturali. Qui descriviamo un flusso di lavoro che combina tre diversi programmi SPA per la determinazione della struttura ad alta risoluzione (Figura 1).

L’obiettivo di SPA è quello di ricostruire i volumi 3D di un campione bersaglio da immagini 2D rumorose registrate da un rilevatore al microscopio. I rilevatori raccolgono immagini come filmati con singoli fotogrammi dello stesso campo visivo. Al fine di preservare il campione, i fotogrammi vengono raccolti con una bassa dose di elettroni e quindi hanno uno scarso rapporto segnale-rumore (SNR). Inoltre, l’esposizione elettronica può indurre movimento all’interno delle griglie crio-EM vetrificate, con conseguente sfocatura dell’immagine. Per superare questi problemi, i fotogrammi sono allineati per correggere il movimento indotto dal fascio e mediati per produrre una micrografia con un SNR aumentato. Queste micrografie vengono quindi sottoposte a stima della funzione di trasferimento del contrasto (CTF) per tenere conto degli effetti della sfocatura e delle aberrazioni imposte dal microscopio. Dalle micrografie corrette CTF, le singole particelle vengono selezionate, estratte e ordinate in medie di classe 2D che rappresentano diversi orientamenti adottati dal campione nel ghiaccio vitreo. L’insieme omogeneo di particelle risultante viene utilizzato come input per la ricostruzione 3D ab initio per generare uno o più modelli grossolani, che vengono poi perfezionati iterativamente per produrre una o più strutture ad alta risoluzione. Dopo la ricostruzione, vengono eseguiti perfezionamenti strutturali per migliorare ulteriormente la qualità e la risoluzione della mappa crio-EM. Infine, o un modello atomico è direttamente derivato dalla mappa, o la mappa è dotata di coordinate atomiche ottenute altrove.

Sono disponibili diversi pacchetti software per eseguire le attività sopra descritte, tra cui ^Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, ^EMAN8, ^IMAGIC9, ^RELION10, ^Scipion11, ^SPIDER12, Xmipp13 e altri. Mentre questi programmi seguono fasi di elaborazione simili, impiegano algoritmi diversi, ad esempio, per selezionare particelle, generare modelli iniziali e perfezionare le ricostruzioni. Inoltre, questi programmi richiedono un livello variabile di conoscenza e intervento dell’utente per funzionare, in quanto alcuni dipendono dalla messa a punto dei parametri che possono fungere da ostacolo per i nuovi utenti. Queste discrepanze spesso si traducono in mappe con qualità e risoluzione incoerenti tra le ^{piattaforme14}, spingendo molti ricercatori a utilizzare più pacchetti software per perfezionare e convalidare i risultati. In questo articolo, evidenziamo l’uso di cryoSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 per ottenere una ricostruzione 3D ad alta risoluzione di AAV, un vettore ampiamente utilizzato per la terapia ^genica15. I suddetti pacchetti software sono gratuiti per gli utenti accademici; cryoSPARC v3 e Scipion 3 richiedono licenze.