CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı
Summary
Bu makalede, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için çeşitli tek parçacıklı veri kümelerine uygulanabilir tek ve sağlam bir iş akışı oluşturmak için üç kriyo-EM işleme platformunun, yani cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3’ün etkili bir şekilde nasıl kullanılacağı açıklanmaktadır.
Abstract
Hem enstrümantasyon hem de görüntü işleme yazılımındaki son gelişmeler, tek parçacıklı kriyo-elektron mikroskobunu (kriyo-EM), yapısal biyologların çok çeşitli makromoleküllerin yüksek çözünürlüklü yapılarını belirlemek için tercih ettikleri yöntem haline getirmiştir. Görüntü işleme ve yapı hesaplaması için yeni ve uzman kullanıcılar tarafından aynı temel iş akışını kolaylaştıran birden fazla yazılım paketi mevcuttur: mikroskop dedektörleri tarafından edinilen filmler, ışın kaynaklı hareket ve kontrast aktarım fonksiyonu (CTF) tahmini için düzeltmeye tabi tutulur. Daha sonra, parçacık görüntüleri yinelemeli 2B ve 3B sınıflandırma için ortalama film karelerinden seçilir ve ayıklanır, ardından 3B yeniden yapılandırma, iyileştirme ve doğrulama yapılır. Çeşitli yazılım paketleri farklı algoritmalar kullandığından ve çalışmak için farklı uzmanlık seviyeleri gerektirdiğinden, ürettikleri 3D haritalar genellikle kalite ve çözünürlük bakımından farklılık gösterir. Böylece, kullanıcılar en iyi sonuçlar için çeşitli programlar arasında düzenli olarak veri aktarırlar. Bu makale, kullanıcıların popüler yazılım paketlerinde bir iş akışında gezinmeleri için bir kılavuz sağlar: adeno ilişkili virüsün (AAV) atomik çözünürlüğe yakın bir yapısını elde etmek için cryoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3. İlk önce cryoSPARC v3 ile bir görüntü işleme boru hattını detaylandırıyoruz, çünkü verimli algoritmaları ve kullanımı kolay GUI’si kullanıcıların bir 3D haritaya hızlı bir şekilde ulaşmalarını sağlıyor. Bir sonraki adımda, parçacık koordinatlarını cryoSPARC v3’te elde edilen en iyi kalitede 3D rekonstrüksiyondan RELION-3 ve Scipion 3’e dönüştürmek ve aktarmak ve 3D haritaları yeniden hesaplamak için PyEM ve şirket içi komut dosyalarını kullanıyoruz. Son olarak, RELION-3 ve Scipion 3’ten algoritmaları entegre ederek ortaya çıkan yapıların daha fazla iyileştirilmesi ve doğrulanması için adımları özetliyoruz. Bu makalede, yüksek çözünürlüklü yapı belirleme için çeşitli veri kümelerine uygulanabilir tek ve sağlam bir iş akışı oluşturmak üzere üç işleme platformunun etkili bir şekilde nasıl kullanılacağını açıklayacağız.
Introduction
Kriyo-elektron mikroskobu (kriyo-EM) ve tek parçacık analizi (SPA), hidratlanmış hallerinde çok çeşitli biyomoleküler montajların yapı tayinini sağlayarak bu makromoleküllerin rollerini atomik detaylarda aydınlatmaya yardımcı olur. Mikroskop optiği, bilgisayar donanımı ve görüntü işleme yazılımındaki gelişmeler, biyomoleküllerin yapılarını 2 Å1,2,3’ün ötesine ulaşan çözünürlükte belirlemeyi mümkün kılmıştır. 2020 yılında Protein Veri Bankası’na (PDB) 2.300’den fazla kriyo-EM yapısı yatırılırken, 20144 yılında 192 yapıya kıyasla, kriyo-EM’nin birçok yapısal biyolog için tercih edilen yöntem haline geldiğini göstermektedir. Burada, yüksek çözünürlüklü yapı tayini için üç farklı SPA programını birleştiren bir iş akışını açıklıyoruz (Şekil 1).
SPA’nın amacı, bir mikroskop dedektörü tarafından kaydedilen gürültülü 2D görüntülerden bir hedef numunenin 3D hacimlerini yeniden yapılandırmaktır. Dedektörler, görüntüleri aynı görüş alanına sahip ayrı karelere sahip filmler olarak toplar. Numuneyi korumak için, çerçeveler düşük elektron dozuyla toplanır ve bu nedenle zayıf bir sinyal-gürültü oranına (SNR) sahiptir. Ek olarak, elektron pozlaması vitrifiye kriyo-EM ızgaraları içinde hareketi indükleyebilir ve görüntü bulanıklığına neden olabilir. Bu sorunların üstesinden gelmek için, çerçeveler ışın kaynaklı hareketi düzeltmek için hizalanır ve artan SNR’ye sahip bir mikrograf üretmek için ortalamaları alınır. Bu mikrograflar daha sonra mikroskop tarafından uygulanan bulanıklaştırma ve sapmaların etkilerini hesaba katmak için Kontrast Transfer Fonksiyonu (CTF) tahminine tabi tutulur. CTF ile düzeltilmiş mikrograflardan, bireysel parçacıklar seçilir, ekstrakte edilir ve vitreus buzdaki numune tarafından benimsenen farklı yönelimleri temsil eden 2D sınıf ortalamalarına ayrılır. Ortaya çıkan homojen parçacık kümesi, kaba bir model veya modeller oluşturmak için ab initio 3D rekonstrüksiyonu için girdi olarak kullanılır ve bunlar daha sonra bir veya daha fazla yüksek çözünürlüklü yapı üretmek için yinelemeli olarak rafine edilir. Rekonstrüksiyondan sonra, kriyo-EM haritasının kalitesini ve çözünürlüğünü daha da iyileştirmek için yapısal iyileştirmeler yapılır. Son olarak, ya bir atomik model doğrudan haritadan türetilir ya da harita başka bir yerde elde edilen atomik koordinatlarla donatılmıştır.
Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 ve diğerleri dahil olmak üzere yukarıda özetlenen görevleri yerine getirmek için farklı yazılım paketleri mevcuttur. Bu programlar benzer işleme adımlarını izlerken, örneğin parçacıkları toplamak, ilk modeller oluşturmak ve rekonstrüksiyonları rafine etmek için farklı algoritmalar kullanırlar. Ek olarak, bu programların çalışması için farklı düzeyde kullanıcı bilgisi ve müdahalesi gerekir, çünkü bazıları yeni kullanıcılar için bir engel teşkil edebilecek parametrelerin ince ayarına bağlıdır. Bu tutarsızlıklar genellikle platformlar arasında tutarsız kalite ve çözünürlüğe sahip haritalara neden olur14 ve birçok araştırmacının sonuçları iyileştirmek ve doğrulamak için birden fazla yazılım paketi kullanmasına neden olur. Bu makalede, gen terapisi için yaygın olarak kullanılan bir vektör olan AAV’nin yüksek çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyonunu elde etmek için kriyoSPARC v3, RELION-3 ve Scipion 3’ün kullanımını vurguladık15. Yukarıda belirtilen yazılım paketleri akademik kullanıcılar için ücretsizdir; cryoSPARC v3 ve Scipion 3 lisans gerektirir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, yüksek çözünürlüklü 3D rekonstrüksiyonlar elde etmek için çeşitli yazılım platformlarında kriyo-EM veri işleme için sağlam bir SPA iş akışı sunuyoruz (Şekil 1). Bu iş akışı çok çeşitli biyolojik makromoleküllere uygulanabilir. Protokolün sonraki adımları, film ön işleme, parçacık toplama ve sınıflandırma ve yapı iyileştirmeleri (Tablo 1) ve doğrulama için çoklu yöntemler dahil olmak üzere <strong cl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Carlos Oscar Sorzano’ya Scipion3 kurulumundaki yardımları için ve Kilian Schnelle ve Arne Moeller’e farklı işleme platformları arasında veri aktarımı konusunda yardımcı oldukları için teşekkür ederiz. Bu araştırmanın bir kısmı NIH hibesi U24GM129547 tarafından desteklendi ve OHSU’daki PNCC’de gerçekleştirildi ve Biyolojik ve Çevresel Araştırmalar Ofisi tarafından desteklenen bir DOE Bilim Ofisi Kullanıcı Tesisi olan EMSL (grid.436923.9) aracılığıyla erişildi. Bu çalışma, Rutgers Üniversitesi’nden Arek Kulczyk’e verilen bir start-up hibesi ile desteklenmiştir.
Materials
| CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. | https://cryosparc.com/ | |
| CTFFIND 4 | Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | |
| MotionCorr2 | UCSF Macromolecular Structure Group | https://msg.ucsf.edu/software | |
| Phenix | Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) | http://www.phenix-online.org/ | |
| PyEM | Univerisity of California, San Francisco | https://github.com/asarnow/pyem | |
| RELION | MRC Laboratory of Structural Biology | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
| Scipion | Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
| UCSF Chimera | UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
References
- Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
- Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
- Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
- PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021)
- Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
- Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
- Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
- Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
- Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020)
- Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- . Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019)
- Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- . MotionCor2 User Manual Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018)
- Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
- . UCSF PyEM v0.5 Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019)
- Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
- Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
- Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
- Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
- Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
- Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194 (2020).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
- Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).
