سير عمل قوي لمعالجة المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryo-EM) باستخدام cryoSPARC و RELION و Scipion
Summary
توضح هذه المقالة كيفية الاستخدام الفعال لثلاث منصات لمعالجة cryo-EM ، أي cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3 ، لإنشاء سير عمل واحد وقوي ينطبق على مجموعة متنوعة من مجموعات بيانات الجسيمات المفردة لتحديد بنية عالية الدقة.
Abstract
جعلت التطورات الحديثة في كل من الأجهزة وبرامج معالجة الصور المجهر الإلكتروني المبرد أحادي الجسيمات (cryo-EM) الطريقة المفضلة لعلماء الأحياء الهيكلية لتحديد الهياكل عالية الدقة لمجموعة واسعة من الجزيئات الكبيرة. تتوفر مجموعات برامج متعددة للمستخدمين الجدد والخبراء لمعالجة الصور وحساب الهيكل ، مما يبسط نفس سير العمل الأساسي: تخضع الأفلام التي يتم الحصول عليها بواسطة كاشفات المجهر للتصحيح لتقدير وظيفة الحركة ونقل التباين (CTF) الناجم عن الحزمة. بعد ذلك ، يتم اختيار صور الجسيمات واستخراجها من إطارات الأفلام المتوسطة للتصنيف التكراري 2D و 3D ، تليها إعادة البناء ثلاثية الأبعاد والصقل والتحقق من الصحة. نظرا لأن حزم البرامج المختلفة تستخدم خوارزميات مختلفة وتتطلب مستويات مختلفة من الخبرة للعمل ، فإن خرائط 3D التي تولدها غالبا ما تختلف في الجودة والدقة. وبالتالي ، يقوم المستخدمون بنقل البيانات بانتظام بين مجموعة متنوعة من البرامج للحصول على أفضل النتائج. توفر هذه الورقة دليلا للمستخدمين للتنقل في سير العمل عبر حزم البرامج الشائعة: cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3 للحصول على بنية دقة شبه ذرية للفيروس المرتبط بالغدة الدرقية (AAV). نقوم أولا بتفصيل خط أنابيب معالجة الصور باستخدام cryoSPARC v3 ، حيث تسمح خوارزمياته الفعالة وواجهة المستخدم الرسومية سهلة الاستخدام للمستخدمين بالوصول بسرعة إلى خريطة ثلاثية الأبعاد. في الخطوة التالية ، نستخدم PyEM والبرامج النصية الداخلية لتحويل ونقل إحداثيات الجسيمات من أفضل جودة لإعادة الإعمار ثلاثية الأبعاد التي تم الحصول عليها في cryoSPARC v3 إلى RELION-3 و Scipion 3 وإعادة حساب الخرائط ثلاثية الأبعاد. وأخيرا، نحدد خطوات لمزيد من التحسين والتحقق من صحة الهياكل الناتجة من خلال دمج خوارزميات من RELION-3 و Scipion 3. في هذه المقالة ، نصف كيفية الاستخدام الفعال لثلاث منصات معالجة لإنشاء سير عمل واحد وقوي ينطبق على مجموعة متنوعة من مجموعات البيانات لتحديد الهيكل عالي الدقة.
Introduction
يتيح الفحص المجهري الإلكتروني المبرد (cryo-EM) وتحليل الجسيمات المفردة (SPA) تحديد بنية مجموعة واسعة من التجمعات الجزيئية الحيوية في حالتها المائية ، مما يساعد على إلقاء الضوء على أدوار هذه الجزيئات الكبيرة بالتفصيل الذري. جعلت التحسينات في بصريات المجهر وأجهزة الكمبيوتر وبرامج معالجة الصور من الممكن تحديد هياكل الجزيئات الحيوية بدقة تتجاوز 2 Å1,2,3. تم إيداع أكثر من 2,300 هيكل من هياكل التبريد EM في بنك بيانات البروتين (PDB) في عام 2020 ، مقارنة ب 192 بنية في عام 20144 ، مما يشير إلى أن cryo-EM أصبح الطريقة المفضلة للعديد من علماء الأحياء الهيكلية. هنا ، نصف سير عمل يجمع بين ثلاثة برامج SPA مختلفة لتحديد بنية عالية الدقة (الشكل 1).
الهدف من SPA هو إعادة بناء أحجام 3D من عينة مستهدفة من صور 2D صاخبة مسجلة بواسطة كاشف المجهر. تجمع أجهزة الكشف الصور كأفلام ذات إطارات فردية من نفس مجال الرؤية. من أجل الحفاظ على العينة ، يتم جمع الإطارات بجرعة إلكترون منخفضة وبالتالي يكون لها نسبة إشارة إلى ضوضاء ضعيفة (SNR). بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي التعرض للإلكترون إلى تحفيز الحركة داخل شبكات التبريد EM المزججة، مما يؤدي إلى عدم وضوح الصورة. للتغلب على هذه المشكلات ، تتم محاذاة الإطارات لتصحيح الحركة التي يسببها الشعاع ومتوسطها لإنتاج ميكروغراف مع زيادة SNR. ثم تخضع هذه المجهر لتقدير دالة نقل التباين (CTF) لحساب آثار عدم التركيز البؤري والانحرافات التي يفرضها المجهر. من الصور المجهرية المصححة بواسطة CTF ، يتم اختيار الجسيمات الفردية واستخراجها وفرزها في متوسطات فئة 2D تمثل اتجاهات مختلفة اعتمدتها العينة في الجليد الزجاجي. يتم استخدام مجموعة الجسيمات المتجانسة الناتجة كمدخلات لإعادة بناء ab initio 3D لإنشاء نموذج أو نماذج خشنة ، والتي يتم تكريرها بعد ذلك بشكل متكرر لإنتاج واحد أو أكثر من الهياكل عالية الدقة. بعد إعادة الإعمار، يتم إجراء تحسينات هيكلية لزيادة تحسين جودة ودقة خريطة cryo-EM. وأخيرا، إما أن يكون النموذج الذري مشتقا مباشرة من الخريطة، أو أن الخريطة مزودة بإحداثيات ذرية تم الحصول عليها في مكان آخر.
تتوفر حزم برامج مختلفة لإنجاز المهام الموضحة أعلاه ، بما في ذلك Appion5 و cisTEM6 و cryoSPARC7 و EMAN8 و IMAGIC9 و RELION10 و Scipion11 و SPIDER12 و Xmipp13 وغيرها. في حين أن هذه البرامج تتبع خطوات معالجة مماثلة، فإنها تستخدم خوارزميات مختلفة، على سبيل المثال، لاختيار الجسيمات، وإنشاء نماذج أولية، وتحسين عمليات إعادة البناء. بالإضافة إلى ذلك ، تتطلب هذه البرامج مستوى متفاوتا من معرفة المستخدم والتدخل للعمل ، حيث يعتمد بعضها على ضبط المعلمات التي يمكن أن تكون بمثابة عقبة أمام المستخدمين الجدد. وغالبا ما تؤدي هذه التناقضات إلى خرائط ذات جودة ودقة غير متناسقتين عبر المنصات14، مما يدفع العديد من الباحثين إلى استخدام حزم برامج متعددة لتحسين النتائج والتحقق من صحتها. في هذه المقالة ، نسلط الضوء على استخدام cryoSPARC v3 و RELION-3 و Scipion 3 للحصول على إعادة بناء ثلاثية الأبعاد عالية الدقة ل AAV ، وهو ناقل يستخدم على نطاق واسع للعلاج الجيني 15. حزم البرامج المذكورة أعلاه مجانية للمستخدمين الأكاديميين. يتطلب cryoSPARC v3 و Scipion 3 تراخيص.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة ، نقدم سير عمل SPA قويا لمعالجة بيانات cryo-EM عبر منصات برمجية مختلفة لتحقيق عمليات إعادة بناء ثلاثية الأبعاد عالية الدقة (الشكل 1). ينطبق سير العمل هذا على مجموعة واسعة من الجزيئات البيولوجية الكبيرة. وترد الخطوات اللاحقة للبروتوكول في الشكل 4، ب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر كارلوس أوسكار سورزانو على المساعدة في تثبيت Scipion3 وكيليان شنيل وآرني مولر للمساعدة في نقل البيانات بين منصات المعالجة المختلفة. تم دعم جزء من هذا البحث من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة U24GM129547 وتم إجراؤه في PNCC في OHSU وتم الوصول إليه من خلال EMSL (grid.436923.9) ، وهو مرفق مستخدم تابع لمكتب العلوم التابع لوزارة الطاقة برعاية مكتب البحوث البيولوجية والبيئية. تم دعم هذه الدراسة من خلال منحة بدء التشغيل من جامعة روتجرز إلى Arek Kulczyk.
Materials
| CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. | https://cryosparc.com/ | |
| CTFFIND 4 | Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | |
| MotionCorr2 | UCSF Macromolecular Structure Group | https://msg.ucsf.edu/software | |
| Phenix | Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) | http://www.phenix-online.org/ | |
| PyEM | Univerisity of California, San Francisco | https://github.com/asarnow/pyem | |
| RELION | MRC Laboratory of Structural Biology | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
| Scipion | Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
| UCSF Chimera | UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
References
- Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
- Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
- Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
- PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021)
- Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
- Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
- Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
- Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
- Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020)
- Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- . Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019)
- Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- . MotionCor2 User Manual Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018)
- Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
- . UCSF PyEM v0.5 Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019)
- Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
- Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
- Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
- Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
- Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
- Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194 (2020).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
- Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).
