クライオスパーク、リオン、サイピオンによる堅牢な単一粒子クライオ電子顕微鏡(クライオEM)処理ワークフロー

クライオ電子顕微鏡(クライオEM)および単粒子分析(SPA)は、水和状態の多種多様な生体分子集合体の構造決定を可能にし、これらの巨大分子の役割を原子で詳細に明らかにするのに役立ちます。顕微鏡光学系、コンピュータハードウェア、および画像処理ソフトウェアの改善により、2 ^Å1、2、3を超える解像度で生体分子の構造を決定することが可能になりました。2014年の192の構造と比較して、2020年には2,300以上のクライオEM構造がタンパク質データバンク(PDB)に寄託され⁴、クライオEMが多くの構造生物学者にとって選択の方法となっていることを示しています。ここでは、高解像度の構造決定のために3つの異なるSPAプログラムを組み合わせたワークフローについて説明します(図1)。

SPAの目標は、顕微鏡検出器によって記録されたノイズの多い2D画像から、ターゲット試料の3Dボリュームを再構築することです。検出器は、同じ視野の個々のフレームを持つムービーとして画像を収集します。サンプルを保存するために、フレームは低い電子線量で収集されるため、信号対雑音比(SNR)が低くなります。さらに、電子露光はガラス化クライオEMグリッド内で動きを誘発し、画像のぼやけをもたらす可能性がある。これらの問題を克服するために、フレームはビーム誘発運動を補正するように整列され、SNRが増加した顕微鏡写真が得られるように平均化される。これらの顕微鏡写真は、顕微鏡によって課される焦点ずれおよび収差の影響を説明するために、コントラスト伝達関数(CTF)推定を受ける。CTF補正顕微鏡写真から、個々の粒子が選択され、抽出され、ガラス質氷中の標本によって採用された異なる配向を表す2Dクラス平均にソートされる。得られた均質なパーティクルのセットは、 ab initio 3D再構成の入力として使用され、粗いモデルが生成され、その後、反復的に洗練されて1つ以上の高解像度構造が生成されます。再構成後、クライオEMマップの品質と解像度をさらに向上させるために、構造的な改良が行われます。最後に、原子モデルがマップから直接派生するか、マップが他の場所で得られた原子座標に適合されます。

^Appion5、cisTEM6、cryoSPARC7、EMAN8、IMAGIC9、RELION10、Scipion11、SPIDER12、^Xmipp13など、上記で概説したタスクを実行するためのさまざまなソフトウェアパッケージが利用可能です。これらのプログラムは同様の処理手順に従いますが、パーティクルの選択、初期モデルの生成、再構成の改良など、さまざまなアルゴリズムを採用しています。さらに、これらのプログラムは、新しいユーザーのハードルとして機能する可能性のあるパラメータの微調整に依存するものもあるため、動作するためにさまざまなレベルのユーザー知識と介入を必要とします。これらの不一致により、プラットフォーム間で一貫性のない品質と解像度のマップが生成されることが多く¹⁴、多くの研究者は複数のソフトウェアパッケージを使用して結果を改良および検証する必要があります。この記事では、クライオスパークv3、RELION-3、およびScipion 3を使用して、遺伝子治療に広く使用されているベクターであるAAVの高解像度3D再構成を得ることを強調します¹⁵。上記のソフトウェアパッケージは、アカデミックユーザーには無料です。cryoSPARC v3 および Scipion 3 にはライセンスが必要です。