Un robusto flujo de trabajo de procesamiento de criomicroscopía electrónica de una sola partícula (cryo-EM) con cryoSPARC, RELION y Scipion

La microscopía crioelectrónica (crio-EM) y el análisis de partículas individuales (SPA) permiten la determinación de la estructura de una amplia variedad de conjuntos biomoleculares en su estado hidratado, ayudando a iluminar el papel de estas macromoléculas en detalle atómico. Las mejoras en la óptica del microscopio, el hardware informático y el software de procesamiento de imágenes han permitido determinar estructuras de biomoléculas a una resolución que supera los 2 ^Å1,2,3. Más de 2.300 estructuras crio-EM se depositaron en el Banco de Datos de Proteínas (PDB) en 2020, en comparación con 192 estructuras en 20144, lo que indica que la crio-EM se ha convertido en el método de elección para muchos biólogos estructurales. Aquí, describimos un flujo de trabajo que combina tres programas SPA diferentes para la determinación de estructuras de alta resolución (Figura 1).

El objetivo de SPA es reconstruir volúmenes 3D de un espécimen objetivo a partir de imágenes 2D ruidosas grabadas por un detector de microscopio. Los detectores recopilan imágenes como películas con fotogramas individuales del mismo campo de visión. Para preservar la muestra, los fotogramas se recogen con una dosis baja de electrones y, por lo tanto, tienen una mala relación señal-ruido (SNR). Además, la exposición a electrones puede inducir movimiento dentro de las rejillas crio-EM vitrificadas, lo que resulta en el desenfoque de la imagen. Para superar estos problemas, los fotogramas se alinean para corregir el movimiento inducido por el haz y se promedian para producir una micrografía con un SNR aumentado. Estas micrografías luego se someten a una estimación de la función de transferencia de contraste (CTF) para tener en cuenta los efectos del desenfoque y las aberraciones impuestas por el microscopio. A partir de las micrografías corregidas por CTF, las partículas individuales se seleccionan, extraen y clasifican en promedios de clase 2D que representan diferentes orientaciones adoptadas por la muestra en hielo vítreo. El conjunto homogéneo resultante de partículas se utiliza como entrada para la reconstrucción 3D ab initio para generar un modelo o modelos gruesos, que luego se refinan iterativamente para producir una o más estructuras de alta resolución. Después de la reconstrucción, se realizan refinamientos estructurales para mejorar aún más la calidad y la resolución del mapa crio-EM. Finalmente, un modelo atómico se deriva directamente del mapa, o el mapa está equipado con coordenadas atómicas obtenidas en otro lugar.

Hay diferentes paquetes de software disponibles para realizar las tareas descritas anteriormente, incluidos ^Appion5, ^cisTEM6, cryoSPARC7, ^EMAN8, ^IMAGIC9, RELION10, Scipion11, ^SPIDER12, Xmipp13 y otros. Si bien estos programas siguen pasos de procesamiento similares, emplean diferentes algoritmos, por ejemplo, para recoger partículas, generar modelos iniciales y refinar reconstrucciones. Además, estos programas requieren un nivel variable de conocimiento e intervención del usuario para operar, ya que algunos dependen del ajuste fino de los parámetros que pueden actuar como un obstáculo para los nuevos usuarios. Estas discrepancias a menudo resultan en mapas con calidad y resolución inconsistentes en todas las ^{plataformas14}, lo que lleva a muchos investigadores a usar múltiples paquetes de software para refinar y validar los resultados. En este artículo destacamos el uso de cryoSPARC v3, RELION-3 y Scipion 3 para obtener una reconstrucción 3D de alta resolución de AAV, un vector ampliamente utilizado para la terapia ^génica15. Los paquetes de software antes mencionados son gratuitos para los usuarios académicos; cryoSPARC v3 y Scipion 3 requieren licencias.