强大的单颗粒冷冻电子显微镜 （cryo-EM） 处理工作流程，具有冷冻 SPARC、RELION 和 Scipion
Summary
本文介绍了如何有效利用三种冷冻电镜处理平台，即 cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 3，创建适用于各种单颗粒数据集的单一且强大的工作流程，以实现高分辨率结构测定。
Abstract
仪器和图像处理软件的最新进展使单粒子冷冻电子显微镜（cryo-EM）成为结构生物学家确定各种大分子高分辨率结构的首选方法。多个软件套件可供新手和专家用户使用，用于图像处理和结构计算，从而简化了相同的基本工作流程：显微镜探测器采集的电影将进行光束诱导运动和对比度传递函数（CTF）估计的校正。接下来，从平均电影帧中选择并提取粒子图像以进行迭代 2D 和 3D 分类，然后进行 3D 重建、细化和验证。由于各种软件包采用不同的算法，并且需要不同程度的专业知识才能运行，因此它们生成的3D地图在质量和分辨率上通常不同。因此，用户定期在各种程序之间传输数据以获得最佳结果。本文为用户提供了在流行的软件包中导航工作流程的指南：cryoSPARC v3，RELION-3和Scipion 3，以获得腺相关病毒（AAV）的近原子分辨率结构。我们首先详细介绍了使用 cryoSPARC v3 的图像处理管道，因为它的高效算法和易于使用的 GUI 使用户能够快速获得 3D 地图。在下一步中，我们使用 PyEM 和内部脚本将粒子坐标从 cryoSPARC v3 中获得的最高质量的 3D 重建转换和传输到 RELION-3 和 Scipion 3，并重新计算 3D 贴图。最后，我们概述了通过集成RELION-3和Scipion 3的算法来进一步改进和验证所得结构的步骤。在本文中，我们将介绍如何有效地利用三个处理平台来创建适用于各种数据集的单一且强大的工作流程，以实现高分辨率结构确定。
Introduction
冷冻电子显微镜（cryo-EM）和单颗粒分析（SPA）能够确定各种生物分子组件在其水合状态下的结构，有助于阐明这些大分子在原子细节中的作用。显微镜光学，计算机硬件和图像处理软件的改进使得在分辨率超过2 Å1，2，3的情况下确定生物分子的结构成为可能。2020年，蛋白质数据库（PDB）中沉积了超过2，300个冷冻电镜结构，而2014年为192个4，这表明冷冻电镜已成为许多结构生物学家的首选方法。在这里，我们描述了一个结合三种不同的SPA程序进行高分辨率结构测定的工作流程（图1）。
SPA的目标是从显微镜检测器记录的嘈杂的2D图像中重建目标标本的3D体积。探测器将图像收集为具有相同视场的单个帧的短片。为了保存样品，以低电子剂量收集帧，因此具有较差的信噪比（SNR）。此外，电子暴露可以在玻璃化的冷冻电镜网格内诱导运动，导致图像模糊。为了克服这些问题，对帧进行对齐以校正光束诱导的运动，并进行平均以产生具有增加SNR的显微照片。然后，这些显微照片进行对比度传递函数（CTF）估计，以解释显微镜施加的散焦和像差的影响。从CTF校正的显微照片中，选择，提取单个颗粒并将其分类为2D级平均值，代表样品在玻璃冰中采用的不同取向。生成的齐次粒子集用作 从头开始3D重建的输入，以生成一个或多个粗略模型，然后迭代细化以产生一个或多个高分辨率结构。重建后，进行结构细化以进一步提高冷冻电镜图的质量和分辨率。最后，要么直接从映射中导出原子模型，要么映射拟合从其他地方获得的原子坐标。
不同的软件包可用于完成上述任务，包括Appion5，cisTEM6，cryoSPARC7，EMAN8，IMAGIC9，RELION10，Scipion11，SPIDER12，Xmipp13等。虽然这些程序遵循类似的处理步骤，但它们采用不同的算法，例如，选择粒子，生成初始模型和优化重建。此外，这些程序需要不同程度的用户知识和干预才能运行，因为有些程序依赖于参数的微调，这些参数可能会成为新用户的障碍。这些差异通常会导致跨平台的地图质量和分辨率不一致14，促使许多研究人员使用多个软件包来优化和验证结果。在本文中，我们将重点介绍使用 cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 3 获得 AAV 的高分辨率 3D 重建，AAV 是基因治疗广泛使用的载体15。上述软件包对学术用户免费;cryoSPARC v3 和 Scipion 3 需要许可证。
Protocol
Representative Results
Discussion
在本文中，我们介绍了一个强大的SPA工作流程，用于跨各种软件平台进行冷冻电镜数据处理，以实现高分辨率的3D重建（图1）。该工作流程适用于各种生物大分子。图4概述了该协议的后续步骤，包括电影预处理，颗粒拾取和分类，以及用于结构细化（表1）和验证的多种方法。已经介绍了 cryoSPARC v3、RELION-3 和 Scipion 3 中的处理?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 Carlos Oscar Sorzano 在 Scipion3 安装方面的帮助，以及 Kilian Schnelle 和 Arne Moeller 在不同处理平台之间传输数据方面的帮助。这项研究的一部分得到了NIH拨款U24GM129547的支持，并在OHSU的PNCC进行，并通过EMSL（grid.436923.9）访问，EMSL是由生物和环境研究办公室赞助的DOE科学用户设施办公室。这项研究得到了罗格斯大学（Rutgers University）向Arek Kulczyk提供的启动资金的支持。
Materials
| CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. | https://cryosparc.com/ | |
| CTFFIND 4 | Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | |
| MotionCorr2 | UCSF Macromolecular Structure Group | https://msg.ucsf.edu/software | |
| Phenix | Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) | http://www.phenix-online.org/ | |
| PyEM | Univerisity of California, San Francisco | https://github.com/asarnow/pyem | |
| RELION | MRC Laboratory of Structural Biology | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
| Scipion | Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
| UCSF Chimera | UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
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