Um fluxo de trabalho robusto de crio-elétron de partículas únicas (crio-EM) com cryoSPARC, RELION e Scipion

A microscopia crio-elétron (crio-EM) e a análise de partículas únicas (SPA) permitem a determinação da estrutura de uma grande variedade de conjuntos biomoleculares em seu estado hidratado, ajudando a iluminar os papéis dessas macromoléculas em detalhes atômicos. Melhorias na óptica de microscópio, hardware de computador e software de processamento de imagens tornaram possível determinar estruturas de biomoléculas em resolução que ultrapassassem 2 ^Å1,2,3. Mais de 2.300 estruturas crio-EM foram depositadas no Protein Data Bank (PDB) em 2020, em comparação com 192 estruturas em ²⁰¹⁴⁴, indicando que o crio-EM tornou-se o método de escolha de muitos biólogos estruturais. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho que combina três programas SPA diferentes para determinação da estrutura de alta resolução (Figura 1).

O objetivo da SPA é reconstruir volumes 3D de um espécime alvo a partir de imagens 2D ruidosas registradas por um detector de microscópio. Os detectores coletam imagens como filmes com quadros individuais do mesmo campo de visão. Para preservar a amostra, os quadros são coletados com uma dose eletrônica baixa e, portanto, têm uma má relação sinal-ruído (SNR). Além disso, a exposição a elétrons pode induzir o movimento dentro das grades crio-EM vitrificadas, resultando em desfoque de imagem. Para superar esses problemas, os quadros estão alinhados para corrigir o movimento induzido pelo feixe e médios para produzir um micrografo com um SNR aumentado. Esses micrografos passam então pela estimativa da Função de Transferência de Contraste (CTF) para explicar os efeitos do desfoco e das aberrações impostas pelo microscópio. A partir dos micrografos corrigidos pelo CTF, as partículas individuais são selecionadas, extraídas e classificadas em médias de classe 2D representando diferentes orientações adotadas pelo espécime em gelo vítreo. O conjunto homogêneo resultante de partículas é usado como entrada para a reconstrução 3D ab iniciado para gerar um modelo ou modelos grosseiros, que são então refinados iterativamente para produzir uma ou mais estruturas de alta resolução. Após a reconstrução, são realizados refinamentos estruturais para melhorar ainda mais a qualidade e a resolução do mapa crio-EM. Finalmente, ou um modelo atômico é diretamente derivado do mapa, ou o mapa é equipado com coordenadas atômicas obtidas em outros lugares.

Diferentes pacotes de software estão disponíveis para realizar as tarefas descritas acima, incluindo ^Appion5, cisTEM6, crioSPARC7, ^EMAN8, ^IMAGIC9, ^RELION10, ^Scipion11, ^SPIDER12, Xmipp13, entre outros. Embora esses programas sigam etapas semelhantes de processamento, eles empregam diferentes algoritmos, por exemplo, para colher partículas, gerar modelos iniciais e refinar reconstruções. Além disso, esses programas exigem um nível variado de conhecimento e intervenção do usuário para operar, pois alguns dependem do ajuste fino de parâmetros que podem atuar como um obstáculo para novos usuários. Essas discrepâncias geralmente resultam em mapas com qualidade e resolução inconsistentes em todas as ^{plataformas14}, levando muitos pesquisadores a usar vários pacotes de software para refinar e validar resultados. Neste artigo, destacamos o uso de crioSPARC v3, RELION-3 e Scipion 3 para obter uma reconstrução 3D de alta resolução do AAV, um vetor amplamente utilizado para terapia ^genética15. Os pacotes de software acima mencionados são gratuitos para usuários acadêmicos; crioSPARC v3 e Scipion 3 exigem licenças.