Надежный рабочий процесс обработки криоэлектронной микроскопии с одной частицей (крио-ЭМ) с криоСПАРК, RELION и Scipion
Summary
В этой статье описывается, как эффективно использовать три платформы обработки крио-ЭМ, т.е. cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3, для создания единого и надежного рабочего процесса, применимого к различным наборам данных с одной частицей для определения структуры с высоким разрешением.
Abstract
Последние достижения в области как приборов, так и программного обеспечения для обработки изображений сделали криоэлектронную микроскопию одной частицы (крио-ЭМ) предпочтительным методом для структурных биологов для определения структур высокого разрешения широкого спектра макромолекул. Для новых и опытных пользователей доступно несколько пакетов программного обеспечения для обработки изображений и расчета структуры, которые оптимизируют один и тот же базовый рабочий процесс: фильмы, полученные детекторами микроскопа, проходят коррекцию для оценки движения и контрастной функции передачи луча (CTF). Затем изображения частиц выбираются и извлекаются из усредненных кадров фильма для итеративной 2D- и 3D-классификации, за которой следует 3D-реконструкция, уточнение и проверка. Поскольку различные программные пакеты используют разные алгоритмы и требуют разного уровня знаний для работы, 3D-карты, которые они генерируют, часто различаются по качеству и разрешению. Таким образом, пользователи регулярно передают данные между различными программами для достижения оптимальных результатов. Этот документ содержит руководство для пользователей по навигации по рабочему процессу в популярных программных пакетах: cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3 для получения структуры, близкой к атомному разрешению аденоассоциированного вируса (AAV). Сначала мы подробно описываем конвейер обработки изображений с помощью cryoSPARC v3, поскольку его эффективные алгоритмы и простой в использовании графический интерфейс позволяют пользователям быстро получить 3D-карту. На следующем этапе мы используем PyEM и собственные скрипты для преобразования и передачи координат частиц из 3D-реконструкции наилучшего качества, полученной в cryoSPARC v3, в RELION-3 и Scipion 3 и пересчитывают 3D-карты. Наконец, мы намечаем шаги для дальнейшего уточнения и валидации результирующих структур путем интеграции алгоритмов из RELION-3 и Scipion 3. В этой статье мы расскажем, как эффективно использовать три платформы обработки для создания единого и надежного рабочего процесса, применимого к различным наборам данных для определения структуры с высоким разрешением.
Introduction
Криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) и анализ одной частицы (SPA) позволяют определять структуру широкого спектра биомолекулярных сборок в их гидратированном состоянии, помогая осветить роль этих макромолекул в атомных деталях. Усовершенствования в оптике микроскопа, компьютерном оборудовании и программном обеспечении для обработки изображений позволили определить структуры биомолекул с разрешением, превышающим 2 Å1,2,3. Более 2 300 крио-ЭМ-структур были депонированы в Банке данных белка (PDB) в 2020 году по сравнению со 192 структурами в 20144 году, что указывает на то, что крио-ЭМ стал методом выбора для многих структурных биологов. Здесь мы описываем рабочий процесс, объединяющий три различные программы SPA для определения структуры с высоким разрешением (рисунок 1).
Целью SPA является реконструкция 3D-объемов целевого образца из шумных 2D-изображений, записанных детектором микроскопа. Детекторы собирают изображения в виде фильмов с отдельными кадрами одного поля зрения. Чтобы сохранить образец, кадры собираются с низкой дозой электронов и, таким образом, имеют плохое отношение сигнал/шум (SNR). Кроме того, воздействие электронов может индуцировать движение внутри остеклованных крио-ЭМ-сеток, что приводит к размытию изображения. Чтобы преодолеть эти проблемы, кадры выравниваются для корректировки движения, вызванного лучом, и усредняются, чтобы получить микрофотографию с увеличенным SNR. Эти микроснимки затем проходят оценку функции переноса контраста (CTF) для учета эффектов расфокусировки и аберраций, наложенных микроскопом. Из микроснимков, скорректированных CTF, отдельные частицы отбираются, извлекаются и сортируются в средние значения 2D-класса, представляющие различные ориентации, принятые образцом в стекловидном льду. Результирующее однородное множество частиц используется в качестве входных данных для ab initio 3D-реконструкции для создания грубой модели или моделей, которые затем итеративно уточняются для получения одной или нескольких структур с высоким разрешением. После реконструкции выполняются структурные доработки для дальнейшего улучшения качества и разрешения крио-ЭМ карты. Наконец, либо атомная модель непосредственно выводится из карты, либо карта снабжена атомными координатами, полученными в другом месте.
Для выполнения описанных выше задач доступны различные пакеты программного обеспечения, включая Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 и другие. Хотя эти программы следуют аналогичным этапам обработки, они используют разные алгоритмы, например, для выбора частиц, создания начальных моделей и уточнения реконструкций. Кроме того, эти программы требуют различного уровня пользовательских знаний и вмешательства для работы, так как некоторые из них зависят от тонкой настройки параметров, которые могут выступать в качестве препятствия для новых пользователей. Эти расхождения часто приводят к картам с несогласованным качеством и разрешением на разных платформах14, что побуждает многих исследователей использовать несколько пакетов программного обеспечения для уточнения и проверки результатов. В этой статье мы освещаем использование cryoSPARC v3, RELION-3 и Scipion 3 для получения 3D-реконструкции AAV с высоким разрешением, широко используемого вектора для генной терапии15. Вышеупомянутые пакеты программного обеспечения бесплатны для академических пользователей; cryoSPARC v3 и Scipion 3 требуют лицензий.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы представляем надежный рабочий процесс SPA для обработки крио-EM данных на различных программных платформах для достижения 3D-реконструкций с высоким разрешением (рисунок 1). Этот рабочий процесс применим к широкому спектру биологических макромолекул. Посл…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Карлоса Оскара Сорцано за помощь в установке Scipion3 и Килиана Шнелле и Арне Мёллера за помощь в передаче данных между различными платформами обработки. Часть этого исследования была поддержана грантом NIH U24GM129547 и выполнена в PNCC в OHSU и доступна через EMSL (grid.436923.9), Пользовательский объект Управления науки Министерства энергетики США, спонсируемый Управлением биологических и экологических исследований. Это исследование было поддержано грантом стартапа от Ратгерского университета Ареку Кульчику.
Materials
| CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. | https://cryosparc.com/ | |
| CTFFIND 4 | Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | |
| MotionCorr2 | UCSF Macromolecular Structure Group | https://msg.ucsf.edu/software | |
| Phenix | Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) | http://www.phenix-online.org/ | |
| PyEM | Univerisity of California, San Francisco | https://github.com/asarnow/pyem | |
| RELION | MRC Laboratory of Structural Biology | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
| Scipion | Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
| UCSF Chimera | UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
References
- Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
- Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
- Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
- PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021)
- Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
- Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
- Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
- Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
- Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020)
- Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- . Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019)
- Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- . MotionCor2 User Manual Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018)
- Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
- . UCSF PyEM v0.5 Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019)
- Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
- Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
- Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
- Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
- Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
- Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194 (2020).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
- Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).
