Een robuuste cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) verwerkingsworkflow met één deeltje met cryoSPARC, RELION en Scipion
Summary
In dit artikel wordt beschreven hoe u effectief gebruik kunt maken van drie cryo-EM-verwerkingsplatforms, d.w.z. cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3, om een enkele en robuuste workflow te creëren die van toepassing is op een verscheidenheid aan datasets met één deeltje voor structuurbepaling met hoge resolutie.
Abstract
Recente ontwikkelingen in zowel instrumentatie- als beeldverwerkingssoftware hebben cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje (cryo-EM) tot de voorkeursmethode gemaakt voor structuurbiologen om structuren met hoge resolutie van een breed scala aan macromoleculen te bepalen. Meerdere softwaresuites zijn beschikbaar voor nieuwe en deskundige gebruikers voor beeldverwerking en structuurberekening, die dezelfde basisworkflow stroomlijnen: films die door de microscoopdetectoren zijn verkregen, ondergaan correctie voor beam-induced motion and contrast transfer function (CTF) schatting. Vervolgens worden deeltjesafbeeldingen geselecteerd en geëxtraheerd uit gemiddelde filmframes voor iteratieve 2D- en 3D-classificatie, gevolgd door 3D-reconstructie, verfijning en validatie. Omdat verschillende softwarepakketten verschillende algoritmen gebruiken en verschillende niveaus van expertise vereisen om te werken, verschillen de 3D-kaarten die ze genereren vaak in kwaliteit en resolutie. Gebruikers dragen dus regelmatig gegevens over tussen verschillende programma’s voor optimale resultaten. Dit artikel biedt een handleiding voor gebruikers om door een workflow te navigeren in de populaire softwarepakketten: cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3 om een bijna atomaire resolutiestructuur van het adeno-geassocieerde virus (AAV) te verkrijgen. We beschrijven eerst een beeldverwerkingspijplijn met cryoSPARC v3, omdat de efficiënte algoritmen en gebruiksvriendelijke GUI gebruikers in staat stellen om snel tot een 3D-kaart te komen. In de volgende stap gebruiken we PyEM en interne scripts om deeltjescoördinaten van de beste kwaliteit 3D-reconstructie verkregen in cryoSPARC v3 naar RELION-3 en Scipion 3 te converteren en over te dragen en 3D-kaarten opnieuw te berekenen. Ten slotte schetsen we stappen voor verdere verfijning en validatie van de resulterende structuren door algoritmen van RELION-3 en Scipion 3 te integreren. In dit artikel beschrijven we hoe u drie verwerkingsplatforms effectief kunt gebruiken om een enkele en robuuste workflow te creëren die van toepassing is op een verscheidenheid aan datasets voor het bepalen van de structuur met hoge resolutie.
Introduction
Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) en single-particle analysis (SPA) maken structuurbepaling mogelijk van een breed scala aan biomoleculaire assemblages in hun gehydrateerde toestand, waardoor de rollen van deze macromoleculen in atomair detail worden verlicht. Verbeteringen in microscoopoptiek, computerhardware en beeldverwerkingssoftware hebben het mogelijk gemaakt om structuren van biomoleculen te bepalen met een resolutie die verder reikt dan 2 Å1,2,3. Meer dan 2.300 cryo-EM-structuren werden in 2020 in de Protein Data Bank (PDB) gedeponeerd, vergeleken met 192 structuren in 20144, wat aangeeft dat cryo-EM de voorkeursmethode is geworden voor veel structuurbiologen. Hier beschrijven we een workflow die drie verschillende SPA-programma’s combineert voor structuurbepaling met hoge resolutie (figuur 1).
Het doel van SPA is om 3D-volumes van een doelmonster te reconstrueren uit luidruchtige 2D-beelden die zijn vastgelegd door een microscoopdetector. Detectoren verzamelen beelden als films met individuele frames van hetzelfde gezichtsveld. Om het monster te behouden, worden frames verzameld met een lage elektronendosis en hebben ze dus een slechte signaal-ruisverhouding (SNR). Bovendien kan blootstelling aan elektronen beweging induceren binnen de verglaasde cryo-EM-rasters, wat resulteert in beeldvervaging. Om deze problemen op te lossen, worden frames uitgelijnd om te corrigeren voor door stralen geïnduceerde beweging en gemiddeld om een micrograaf met een verhoogde SNR op te leveren. Deze micrografieën ondergaan vervolgens een CTF-schatting (Contrast Transfer Function) om rekening te houden met de effecten van onscherpte en aberraties die door de microscoop worden opgelegd. Uit de CTF-gecorrigeerde micrografieën worden individuele deeltjes geselecteerd, geëxtraheerd en gesorteerd in 2D-klassegemiddelden die verschillende oriëntaties vertegenwoordigen die door het monster in glasachtig ijs worden aangenomen. De resulterende homogene verzameling deeltjes wordt gebruikt als input voor ab initio 3D-reconstructie om een grof model of modellen te genereren, die vervolgens iteratief worden verfijnd om een of meer structuren met hoge resolutie te produceren. Na de reconstructie worden structurele verfijningen uitgevoerd om de kwaliteit en resolutie van de cryo-EM-kaart verder te verbeteren. Ten slotte wordt ofwel een atoommodel rechtstreeks afgeleid van de kaart, ofwel is de kaart uitgerust met atoomcoördinaten die elders zijn verkregen.
Er zijn verschillende softwarepakketten beschikbaar om de hierboven beschreven taken uit te voeren, waaronder Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, EMAN8, IMAGIC9, RELION10, Scipion11, SPIDER12, Xmipp13 en andere. Hoewel deze programma’s vergelijkbare verwerkingsstappen volgen, gebruiken ze verschillende algoritmen, bijvoorbeeld om deeltjes te selecteren, initiële modellen te genereren en reconstructies te verfijnen. Bovendien vereisen deze programma’s een variërend niveau van gebruikerskennis en interventie om te werken, omdat sommige afhankelijk zijn van de fijnafstelling van parameters die als een hindernis voor nieuwe gebruikers kunnen fungeren. Deze discrepanties resulteren vaak in kaarten met inconsistente kwaliteit en resolutie op verschillende platforms14, waardoor veel onderzoekers ertoe worden aangezet meerdere softwarepakketten te gebruiken om resultaten te verfijnen en te valideren. In dit artikel belichten we het gebruik van cryoSPARC v3, RELION-3 en Scipion 3 om een hoge resolutie 3D-reconstructie te verkrijgen van AAV, een veelgebruikte vector voor gentherapie15. De bovengenoemde softwarepakketten zijn gratis voor academische gebruikers; cryoSPARC v3 en Scipion 3 vereisen licenties.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel presenteren we een robuuste SPA-workflow voor cryo-EM-gegevensverwerking op verschillende softwareplatforms om 3D-reconstructies met hoge resolutie te bereiken (figuur 1). Deze workflow is toepasbaar op een breed scala aan biologische macromoleculen. De volgende stappen van het protocol worden beschreven in figuur 4, inclusief filmvoorbewerking, deeltjesverzameling en -classificatie en meerdere methoden voor structuurverfijningen (tabel </…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Carlos Oscar Sorzano voor hulp bij de installatie van Scipion3 en Kilian Schnelle en Arne Moeller voor hulp bij gegevensoverdracht tussen verschillende verwerkingsplatforms. Een deel van dit onderzoek werd ondersteund door NIH-subsidie U24GM129547 en uitgevoerd bij de PNCC bij OHSU en toegankelijk via EMSL (grid.436923.9), een DOE Office of Science User Facility gesponsord door het Office of Biological and Environmental Research. Deze studie werd ondersteund door een start-up grant van Rutgers University aan Arek Kulczyk.
Materials
| CryoSPARC | Structura Biotechnology Inc. | https://cryosparc.com/ | |
| CTFFIND 4 | Howard Hughes Medical Institute, UMass Chan Medical School | https://grigoriefflab.umassmed.edu/ctffind4 | |
| MotionCorr2 | UCSF Macromolecular Structure Group | https://msg.ucsf.edu/software | |
| Phenix | Computational Tools for Macromolecular Neutron Crystallography (MNC) | http://www.phenix-online.org/ | |
| PyEM | Univerisity of California, San Francisco | https://github.com/asarnow/pyem | |
| RELION | MRC Laboratory of Structural Biology | https://www3.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion/index.php/Main_Page | |
| Scipion | Instruct Image Processing Center (I2PC), SciLifeLab | http://scipion.i2pc.es/ | |
| UCSF Chimera | UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ |
References
- Bartesaghi, A., et al. Atomic resolution Cryo-EM structure of beta-galactosidase. Structure. 26 (6), 848-856 (2018).
- Merk, A., et al. Breaking Cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
- Wardell, M., et al. The atomic structure of human methemalbumin at 1.9 A. Biochemical and Biophysical Research Communications. 291 (4), 813-819 (2002).
- PDB statistics: Growth of Structures from 3DEM Experiments Released per Year. RCSB PDB Available from: https://www.rcsb.org/stats/growth/growth-em (2021)
- Lander, G. C., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
- Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383 (2018).
- Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nature Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
- Tang, G., et al. EMAN2: an extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
- van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
- Scheres, S. H. RELION: Implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
- de la Rosa-Trevin, J. M., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
- Shaikh, T. R., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
- Sorzano, C. O., et al. XMIPP: a new generation of an open-source image processing package for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 148 (2), 194-204 (2004).
- Lawson, C. L., Chiu, W. Comparing cryo-EM structures. Journal of Structural Biology. 204 (3), 523-526 (2018).
- Naso, M. F., Tomkowicz, B., Perry, W. L., Strohl, W. R. Adeno-associated virus (AAV) as a vector for gene therapy. BioDrugs. 31 (4), 317-334 (2017).
- Cryo-EM data processing in cryoSPARC: Introductory Tutorial. at Available from: https://guide.cryosparc.com/processing-data/cryo-em-data-processing-in-cryosparc-introductory-tutorial (2020)
- Bepler, T., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nature Communications. 11 (5208), (2020).
- Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera-a visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
- . Single-particle processing in RELION-3.1 Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/relion31_tutorial.pdf (2019)
- Zheng, S. Q., Palovcak, E., Armache, J. P., Verba, K. A., Cheng, Y., Agard, D. A. MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy. Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).
- . MotionCor2 User Manual Available from: https://hpc.nih.gov/apps/RELION/MotionCor2-UserManual-05-03-2018.pdf (2018)
- Rohou, A., Grigorieff, N. CTFFIND4: Fast and accurate defocus estimation from electron micrographs. Journal of Structural Biology. 192 (2), 216-221 (2015).
- . UCSF PyEM v0.5 Available from: https://github.com/asarnow/pyem (2019)
- Sorzano, C. O. S., et al. A new algorithm for high-resolution reconstruction of single particles by electron microscopy. Journal of Structural Biology. 204 (2), 329-337 (2018).
- Jimenez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with Scipion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261 (2021).
- Adams, P. D., et al. PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66, 213-221 (2010).
- Vilas, J. L., et al. MonoRes: Automatic and accurate estimation of local resolution for electron microscopy maps. Structure. 26 (2), 337-344 (2018).
- Sorzano, C. O., et al. A clustering approach to multireference alignment of single-particle projections in electron microscopy. Journal of Structural Biology. 171 (2), 197-206 (2010).
- Penczek, P. A. Resolution measures in molecular electron microscopy. Methods in Enzymology. 482, 73-100 (2010).
- Xie, Q., Yoshioka, C. K., Chapman, M. S. Adeno-associated virus (AAV-DJ)-Cryo-EM structure at 1.56 A Resolution. Viruses. 12 (10), 1194 (2020).
- Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
- Kulczyk, A. W., Moeller, A., Meyer, P., Sliz, P., Richardson, C. C. Cryo-EM structure of the replisome reveals multiple interaction coordinating DNA synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1848-1856 (2017).
