Un flux de travail robuste de traitement par cryo-microscopie électronique (cryo-EM) à particule unique avec cryoSPARC, RELION et Scipion

La cryo-microscopie électronique (cryo-EM) et l’analyse monoparticulaire (SPA) permettent de déterminer la structure d’une grande variété d’assemblages biomoléculaires à l’état hydraté, contribuant ainsi à éclairer les rôles de ces macromolécules dans les détails atomiques. Les améliorations apportées à l’optique du microscope, au matériel informatique et aux logiciels de traitement d’images ont permis de déterminer les structures des biomolécules à une résolution supérieure à 2 ^Å1,2,3. Plus de 2 300 structures cryo-EM ont été déposées dans la banque de données sur les protéines (PDB) en 2020, contre 192 structures en 20144, ce qui indique que la cryo-EM est devenue la méthode de choix pour de nombreux biologistes structuraux. Nous décrivons ici un flux de travail combinant trois programmes SPA différents pour la détermination de la structure à haute résolution (Figure 1).

L’objectif de SPA est de reconstruire les volumes 3D d’un spécimen cible à partir d’images 2D bruyantes enregistrées par un détecteur de microscope. Les détecteurs collectent des images sous forme de films avec des images individuelles du même champ de vision. Afin de préserver l’échantillon, les trames sont collectées avec une faible dose d’électrons et ont donc un faible rapport signal/bruit (SNR). De plus, l’exposition aux électrons peut induire un mouvement dans les grilles cryo-EM vitrifiées, ce qui entraîne un flou de l’image. Pour surmonter ces problèmes, les cadres sont alignés pour corriger le mouvement induit par le faisceau et moyennés pour produire une micrographie avec un SNR accru. Ces micrographies subissent ensuite une estimation de la fonction de transfert de contraste (CTF) pour tenir compte des effets de la mise au point et des aberrations imposées par le microscope. À partir des micrographies corrigées par le CTF, les particules individuelles sont sélectionnées, extraites et triées en moyennes de classe 2D représentant différentes orientations adoptées par l’échantillon dans la glace vitrée. L’ensemble homogène de particules résultant est utilisé comme entrée pour la reconstruction 3D ab initio afin de générer un ou plusieurs modèles grossiers, qui sont ensuite affinés de manière itérative pour produire une ou plusieurs structures à haute résolution. Après la reconstruction, des améliorations structurelles sont effectuées pour améliorer encore la qualité et la résolution de la carte cryo-EM. Enfin, soit un modèle atomique est directement dérivé de la carte, soit la carte est équipée de coordonnées atomiques obtenues ailleurs.

Différents progiciels sont disponibles pour accomplir les tâches décrites ci-dessus, notamment ^Appion5, cisTEM6, cryoSPARC7, ^EMAN8, IMAGIC9, ^RELION10, Scipion11, ^SPIDER12, Xmipp13 et autres. Bien que ces programmes suivent des étapes de traitement similaires, ils utilisent différents algorithmes, par exemple, pour sélectionner des particules, générer des modèles initiaux et affiner les reconstructions. De plus, ces programmes nécessitent un niveau variable de connaissances et d’intervention de l’utilisateur pour fonctionner, car certains dépendent du réglage fin des paramètres qui peuvent constituer un obstacle pour les nouveaux utilisateurs. Ces écarts se traduisent souvent par des cartes de qualité et de résolution incohérentes sur toutes les plates-formes14, ce qui incite de nombreux chercheurs à utiliser plusieurs progiciels pour affiner et valider les résultats. Dans cet article, nous soulignons l’utilisation de cryoSPARC v3, RELION-3 et Scipion 3 pour obtenir une reconstruction 3D haute résolution de l’AAV, un vecteur largement utilisé pour la thérapie ^génique15. Les progiciels susmentionnés sont gratuits pour les utilisateurs académiques; cryoSPARC v3 et Scipion 3 nécessitent des licences.