Çapraz Bağlı ve Tek Mikrotübüllerin Dinamiğinin In Vitro TIRF Mikroskobu ile Eşzamanlı Görselleştirilmesi
Summary
Burada, iki mikrotübül popülasyonunun dinamiklerini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için TIRF mikroskopi tabanlı in vitro resusyon testi sunulmaktadır. Çapraz bağlı mikrotübül demetleri ve tek mikrotübüller üzerindeki çoklu mikrotübül ile ilişkili proteinlerin kolektif aktivitesini eşzamanlı olarak görüntülemek için bir yöntem açıklanmaktadır.
Abstract
Mikrotübüller, hücrelerde farklı yapılara organize olan αβ-tübülin heterodimerlerinin polimerleridir. Mikrotübül tabanlı mimariler ve ağlar genellikle dinamik özelliklerinde farklılık gösteren mikrotübül dizilerinin alt kümelerini içerir. Örneğin, bölünen hücrelerde, çapraz bağlı mikrotübüllerin kararlı demetleri, dinamik çapraz bağlı olmayan mikrotübüllere yakın bir yerde bir arada bulunur. TIRF-mikroskopi tabanlı in vitro sulandırma çalışmaları, bu farklı mikrotübül dizilerinin dinamiklerinin eşzamanlı olarak görselleştirilmesini sağlar. Bu tahlilde, bir görüntüleme odası, tek filamentler halinde bulunan veya çapraz bağlı demetler halinde organize edilen yüzey immobilize mikrotübüllerle birleştirilir. Tübülin, nükleotitler ve protein düzenleyicilerinin tanıtılması, ilişkili proteinlerin ve tek ve çapraz bağlı mikrotübüllerin dinamik özelliklerinin doğrudan görselleştirilmesini sağlar. Ayrıca, dinamik tek mikrotübüller demetler halinde organize olurken meydana gelen değişiklikler gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Burada açıklanan yöntem, bireysel proteinlerin aktivitesinin ve lokalizasyonunun sistematik bir değerlendirmesinin yanı sıra, protein düzenleyicilerinin aynı deneysel koşullar altında iki farklı mikrotübül alt kümesi üzerindeki sinerjik etkilerinin sistematik bir şekilde değerlendirilmesine izin verir, böylece diğer yöntemlerle erişilemeyen mekanik bilgiler sağlar.
Introduction
Mikrotübüller, hücre içi taşıma ve organel konumlandırmasından hücre bölünmesi ve uzamasına kadar çoklu hücresel süreçler için gerekli olan yapısal iskeleleri oluşturan biyopolimerlerdir. Bu çeşitli işlevleri yerine getirmek için, bireysel mikrotübüller mitotik iğler, siliyer aksonemler, nöronal demetler, interfaz dizileri ve bitki kortikal dizileri gibi mikron boyutlu diziler halinde düzenlenir. Bu yapılarda bulunan her yerde bulunan bir mimari motif, uzunlukları boyunca çapraz bağlanmış bir mikrotübül demetidir1. Birkaç mikrotübül bazlı yapının ilgi çekici bir özelliği, demetlenmiş mikrotübüllerin ve çapraz bağlı olmayan tek mikrotübüllerin yakın uzamsal yakınlıkta bir arada bulunmasıdır. Bu mikrotübül alt popülasyonları, düzgün işlevleri için gerektiği gibi, birbirlerinden çok farklı polimerizasyon dinamikleri gösterebilir2,3,4,5. Örneğin, mitotik iş mili içinde, hücre merkezindeki mikron ölçekli bir bölgede kararlı çapraz bağlı demetler ve dinamik tek mikrotübüller bulunur6. Bu nedenle, birlikte bulunan mikrotübül popülasyonlarının dinamik özelliklerinin nasıl belirlendiğinin incelenmesi, mikrotübül bazlı yapıların montajını ve işlevini anlamak için merkezidir.
Mikrotübüller, polimerizasyon ve depolimerizasyon aşamaları arasında geçiş yapan, felaket ve kurtarma olarak bilinen olaylarda iki faz arasında geçiş yapan dinamik polimerlerdir7. Hücresel mikrotübüllerin dinamikleri, mikrotübül polimerizasyonu ve depolimerizasyon oranlarını ve felaket ve kurtarma olaylarının frekanslarını modüle eden sayısız Mikrotübül İlişkili Protein (MAP’ler) tarafından düzenlenir. Işık mikroskobunda, özellikle de yüksek mikrotübül yoğunluğuna sahip bölgelerde, uzamsal çözünürlüğün sınırlamaları nedeniyle, hücrelerdeki uzamsal proksimal diziler üzerindeki MAP’lerin aktivitesini araştırmak zordur. Dahası, aynı hücresel bölgede birden fazla MAP’nin varlığı, hücre biyolojik çalışmalarının yorumlanmasını engellemektedir. Toplam İç Yansıma Floresan (TIRF) mikroskobu ile birlikte gerçekleştirilen in vitro sulandırma testleri, MAP’lerin belirli alt kümelerinin proksimal hücresel mikrotübül dizilerinin dinamiklerini düzenlediği mekanizmaları incelemenin zorluklarını aşmaktadır. Burada, in vitro olarak monte edilen mikrotübüllerin dinamikleri, kontrollü koşullar altında bir veya daha fazla rekombinant MAP’nin varlığında incelenir8,9,10. Bununla birlikte, geleneksel sulandırma testleri tipik olarak tek mikrotübüller veya bir dizi türü üzerinde gerçekleştirilir ve birlikte var olan popülasyonların görselleştirilmesini engeller.
Burada, aynı çözelti koşulları altında iki mikrotübül popülasyonunun eşzamanlı olarak görselleştirilmesini sağlayan in vitro sulandırma testleri sunuyoruz11. Tek mikrotübüller ve mitotik iğle ilişkili protein PRC1 tarafından çapraz bağlanmış mikrotübül demetleri üzerinde birden fazla MAP’nin kolektif aktivitesini aynı anda görüntülemek için bir yöntem açıklıyoruz. PRC1 proteini tercihen anti-paralel mikrotübüller arasındaki örtüşmeye bağlanır ve onları çapraz bağlar9. Kısaca, bu protokol aşağıdaki adımlardan oluşur: (i) stok çözeltilerinin ve reaktiflerin hazırlanması, (ii) mikroskopi deneyleri için görüntüleme odasını oluşturmak için kullanılan kapak fişlerinin temizlenmesi ve yüzey işlemi, (iii) deney sırasında polimerizasyonun başlatıldığı kararlı mikrotübül “tohumlarının” hazırlanması, (iv) mikrotübül dinamiklerini görselleştirmek için TIRF mikroskop ayarlarının spesifikasyonu, (v) mikrotübül tohumlarının immobilizasyonu ve çapraz bağlı mikrotübül demetlerinin üretilmesi görüntüleme odasında ve (vi) çözünür tübülin, MAP’ler ve nükleotidlerin eklenmesi üzerine TIRF mikroskobu ile görüntüleme odasındaki mikrotübül dinamiklerinin görselleştirilmesi. Bu testler, MAP lokalizasyonunun ve bunların iki mikrotübül popülasyonunun dinamikleri üzerindeki etkilerinin nitel olarak değerlendirilmesini ve nicel olarak incelenmesini sağlar. Ek olarak, çoklu MAP’lerin bu mikrotübül popülasyonları üzerindeki sinerjik etkilerinin çok çeşitli deneysel koşullarda değerlendirilmesini kolaylaştırırlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan deney, geleneksel olarak tek mikrotübüller veya bir dizi türü üzerinde gerçekleştirilen geleneksel mikrotübül sulandırma tahlillerinin kapsamını ve karmaşıklığını önemli ölçüde genişletmektedir. Mevcut tahlil, iki popülasyonda, yani tek mikrotübüller ve çapraz bağlı demetler üzerindeki düzenleyici MAP aktivitesini aynı anda ölçmek ve karşılaştırmak için bir yöntem sunmaktadır. Ayrıca, bu tahlil iki tür demetin incelenmesine izin verir: dinamiklerin başlatılm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, NIH’den (no. 1DP2GM126894-01) bir hibe ve Pew Charitable Trusts ve Smith Family Foundation’dan R.S.’ye sağlanan fonlarla desteklendi. Yazarlar, protokollerin geliştirilmesine ve optimizasyonuna yaptığı katkılardan dolayı Dr. Shuo Jiang’a teşekkür eder.
Materials
| (±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma Aldrich | 238813 | |
| 1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma Aldrich | P6757 | |
| 18×18 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63787 | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M-6250 | |
| 24×60 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
| 405/488/560/647 nm Laser Quad Band | Chroma | TRF89901-NK | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 320110 | |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma Aldrich | A7699-5G | |
| Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®) | Thermo Fischer Scientific | A2666 | |
| Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner | Branson | CPX2800H | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343778 | |
| Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343776 | |
| Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | Laysan Bio | #Biotin-PEG-SVA-5000 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 2905 | |
| Catalase | Sigma Aldrich | C40 | |
| Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V | Corning | 6670 | |
| Delicate Task Wipes | Kimtech | 34120 | |
| Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT10 | |
| Emission filter | Chroma | ET610/75m | |
| Ethanol (200-proof) | Decon Labs | 2705 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 3777 | |
| Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | G2133 | |
| GMPCPP | Jena Bioscience | NU-405 | |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma Aldrich | G8877 | |
| Hellmanex III detergent | Sigma Aldrich | Z805939 | |
| Immersion oil, Type A | Fisher Scientific | 77010 | |
| Kappa-casein | Sigma Aldrich | C0406 | |
| Lanolin | Fisher Scientific | S25376 | |
| Lens Cleaning Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272 | |
| Methylcellulose | Sigma Aldrich | M0512 | |
| Microfuge 16 Benchtop Centrifuge | Beckman-Coulter | A46474 | |
| Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted | Globe Scientific | 1380-50W | |
| mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 | Laysan Bio | #NH2-PEG-VA-5K | |
| Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | 393315 | |
| Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
| PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers | Ted Pella | 5377-NM | |
| Petrolatum, White | Fisher Scientific | 18-605-050 | |
| Plasma Cleaner, 115V | Harrick Plasma | PDC-001 | |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1101 | |
| Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes | USA Scientific | 2520-0000 | |
| Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM | Thermo Fischer Scientific | PI-77720 | |
| TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective | Nikon | CFI Apochromat TIRF 100XC Oil | |
| TIRF microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| TLA 120.1 rotor | Beckman-Coulter | 362224 | |
| TLA 120.2 rotor | Beckman-Coulter | 357656 | |
| Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton | T240 | |
| Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain | Cytoskeleton | T333P | |
| Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain | Cytoskeleton | TL670M | |
| Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain | Cytoskeleton | TL620M | |
| VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion | Vector Biolabs | SP-1800-7 | |
| VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A | VWR | 97025-630 | |
References
- Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
- Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
- Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape. Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).
- Foe, V. E., von Dassow, G. Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation. The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).
- Pous, C., et al. Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells. The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).
- Uehara, R., Goshima, G. Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase. The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).
- Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
- Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
- Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
- Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
- Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module. Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).
- Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
- Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
- Wijeratne, S., Subramanian, R. Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A. eLife. 7, 32595 (2018).
- Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization. eLife. 10, 63880 (2021).
- Freal, A., et al. Feedback-driven assembly of the axon initial segment. Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).
- Ledbetter, M., Porter, K. A "microtubule" in plant cell fine structure. The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).
- Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).
