Visualização Simultânea da Dinâmica dos Microtúbulos Cruzados e Únicos In Vitro pela Microscopia TIRF

Microtúbulos são biopolímeros que formam andaimes estruturais essenciais para múltiplos processos celulares, desde transporte intracelular e posicionamento de organela até divisão celular e alongamento. Para executar essas diversas funções, microtúbulos individuais são organizados em matrizes do tamanho de micron, como fusos mitotísticos, axônios ciliares, feixes neuronais, matrizes interfásicas e matrizes corticais vegetais. Um motivo arquitetônico onipresente encontrado nessas estruturas é um feixe de microtúbulos interligados ao longo de seus ^{comprimentos1}. Uma característica intrigante de várias estruturas baseadas em microtúbulos é a coexistência de microtúbulos empacotados e microtúbulos únicos não-cruzados nas proximidades espaciais próximas. Essas subpopulações de microtúbulos podem exibir dinâmicas de polimerização totalmente diferentes umas das outras, conforme necessário para sua função adequada2,3,4,5. Por exemplo, dentro do eixo mitotístico, pacotes interligados estáveis e microtúbulos únicos dinâmicos estão presentes dentro de uma região de escala de micron no centro ^celular6. Estudar como as propriedades dinâmicas das populações de microtúbulos coexistindo são especificadas é, portanto, central para entender a montagem e função das estruturas baseadas em microtúbulos.

Microtúbulos são polímeros dinâmicos que pedalam entre fases de polimerização e despolimerização, alternando entre as duas fases em eventos conhecidos como catástrofe e ^resgate7. A dinâmica dos microtúbulos celulares é regulada por uma miríade de Proteínas Associadas a Microtúbulos (MAPs) que modulam as taxas de polimerização e despomerização de microtúbulos e as frequências de eventos de catástrofe e resgate. É desafiador investigar a atividade de MAPs em matrizes espacialmente proximais nas células, devido às limitações da resolução espacial na microscopia de luz, especialmente em regiões de alta densidade de microtúbulos. Além disso, a presença de múltiplos MAPs na mesma região celular dificulta interpretações de estudos biológicos celulares. Ensaios de reconstituição in vitro, realizados em conjunto com a microscopia de Fluorescência De Reflexão Interna Total (TIRF), contornam os desafios de examinar mecanismos pelos quais subconjuntos específicos de MAPs regulam a dinâmica das matrizes de microtúbulos celulares proximais. Aqui, a dinâmica dos microtúbulos montados in vitro são examinadas na presença de um ou mais MAPs recombinantes em condições controladas8,9,10. No entanto, os ensaios convencionais de reconstituição são tipicamente realizados em microtúbulos únicos ou em um tipo de matriz, impedindo a visualização de populações coexistindo.

Aqui, apresentamos ensaios de reconstituição in vitro que permitem a visualização simultânea de duas populações de microtúbulos sob as mesmas condições de ^solução11. Descrevemos um método para visualizar simultaneamente a atividade coletiva de múltiplos MAPs em microtúbulos únicos e em feixes de microtúbulos interligados pela proteína mitomática associada ao fuso PRC1. A proteína PRC1 se liga preferencialmente à sobreposição entre microtúbulos anti-paralelos, cruzando-os9. Resumidamente, este protocolo consiste nas seguintes etapas: (i) preparação de soluções de estoque e reagentes, (ii) limpeza e tratamento superficial de deslizamentos de cobertura usados para criar a câmara de imagem para experimentos de microscopia, (iii) preparação de “sementes” de microtúbulos estáveis a partir das quais a polimerização é iniciada durante o experimento, (iv) especificação das configurações do microscópio TIRF para visualizar a dinâmica dos microtúbulos, (v) a imobilização de sementes de microtúbulos e a geração de feixes de microtúbulos transligados na câmara de imagem, e (vi) visualização da dinâmica do microtúbulo na câmara de imagem através da microscopia TIRF, mediante a adição de tubulina solúvel, MAPs e nucleotídeos. Esses ensaios permitem a avaliação qualitativa e o exame quantitativo da localização do MAP e seu efeito na dinâmica de duas populações microtúbulas. Além disso, facilitam a avaliação dos efeitos sinérgicos de múltiplos MAPs nessas populações de microtúbulos, em uma ampla gama de condições experimentais.