هنا ، يتم تقديم فحص إعادة تشكيل مجهري TIRF قائم على المختبر لتحديد ومقارنة ديناميكيات مجموعتين من الأنابيب الدقيقة في وقت واحد. يتم وصف طريقة لعرض النشاط الجماعي للبروتينات المتعددة المرتبطة بالأنابيب الدقيقة في وقت واحد على حزم الأنابيب الدقيقة المتقاطعة والأنابيب الدقيقة المفردة.
الأنابيب الدقيقة هي بوليمرات من αβ-tubulin heterodimers التي تنظم في هياكل متميزة في الخلايا. غالبا ما تحتوي المعماريات والشبكات القائمة على الأنابيب الدقيقة على مجموعات فرعية من صفائف الأنابيب الدقيقة التي تختلف في خصائصها الديناميكية. على سبيل المثال ، في تقسيم الخلايا ، تتعايش حزم مستقرة من الأنابيب الدقيقة المتقاطعة على مقربة من الأنابيب الدقيقة الديناميكية غير المترابطة. تمكن دراسات إعادة التشكيل في المختبر القائمة على TIRF المجهري من التصور المتزامن لديناميكيات هذه المصفوفات المختلفة من الأنابيب الدقيقة. في هذا الفحص ، يتم تجميع غرفة التصوير باستخدام الأنابيب الدقيقة المجمدة على السطح ، والتي إما موجودة كخيوط مفردة أو منظمة في حزم متقاطعة. يسمح إدخال التوبولين والنيوكليوتيدات ومنظمات البروتين بالتصور المباشر للبروتينات المرتبطة والخصائص الديناميكية للأنابيب الدقيقة المفردة والمتشابكة. علاوة على ذلك ، يمكن مراقبة التغييرات التي تحدث عندما يتم تنظيم الأنابيب الدقيقة المفردة الديناميكية في حزم في الوقت الفعلي. تسمح الطريقة الموصوفة هنا بإجراء تقييم منهجي لنشاط البروتينات الفردية وتوطينها ، بالإضافة إلى التأثيرات التآزرية لمنظمات البروتين على مجموعتين فرعيتين مختلفتين من الأنابيب الدقيقة في ظل ظروف تجريبية متطابقة ، وبالتالي توفير رؤى ميكانيكية لا يمكن الوصول إليها بطرق أخرى.
الأنابيب الدقيقة هي بوليمرات حيوية تشكل سقالات هيكلية ضرورية لعمليات خلوية متعددة ، تتراوح من النقل داخل الخلايا وتحديد مواقع العضيات إلى انقسام الخلايا واستطالتها. لتنفيذ هذه الوظائف المتنوعة ، يتم تنظيم الأنابيب الدقيقة الفردية في صفائف بحجم ميكرون ، مثل المغزل الانقسامي ، والمحاور الهدبية ، والحزم العصبية ، والمصفوفات بين الأطوار ، والمصفوفات القشرية النباتية. ومن الزخارف المعمارية المنتشرة في كل مكان الموجودة في هذه الهياكل مجموعة من الأنابيب الدقيقة المتشابكة على طول أطوالها1. ومن السمات المثيرة للاهتمام للعديد من الهياكل القائمة على الأنابيب الدقيقة التعايش بين الأنابيب الدقيقة المجمعة والأنابيب الدقيقة المفردة غير المتقاطعة في مكان قريب. يمكن لهذه المجموعات الفرعية من الأنابيب الدقيقة أن تعرض ديناميكيات بلمرة مختلفة بشكل صارخ عن بعضها البعض ، حسب الحاجة لوظيفتها المناسبة2،3،4،5. على سبيل المثال، داخل المغزل الانقسامي، توجد حزم متقاطعة مستقرة وأنابيب دقيقة مفردة ديناميكية داخل منطقة على نطاق ميكرون في مركز الخلية6. وبالتالي ، فإن دراسة كيفية تحديد الخصائص الديناميكية لمجموعات الأنابيب الدقيقة المتعايشة أمر أساسي لفهم تجميع ووظيفة الهياكل القائمة على الأنابيب الدقيقة.
الأنابيب الدقيقة هي بوليمرات ديناميكية تدور بين مراحل البلمرة وإزالة البلمرة ، وتنتقل بين المرحلتين في الأحداث المعروفة باسم الكارثة والإنقاذ7. يتم تنظيم ديناميكيات الأنابيب الدقيقة الخلوية من خلال عدد لا يحصى من البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة (MAPs) التي تعدل معدلات بلمرة الأنابيب الدقيقة وإزالة البلمرة وترددات أحداث الكوارث والإنقاذ. ومن الصعب التحقيق في نشاط MAPs على المصفوفات القريبة مكانيا في الخلايا، بسبب محدودية الاستبانة المكانية في الفحص المجهري الضوئي، وخاصة في المناطق ذات الكثافة العالية للأنابيب الدقيقة. علاوة على ذلك ، فإن وجود MAPs متعددة في نفس المنطقة الخلوية يعيق تفسيرات الدراسات البيولوجية الخلوية. تعمل فحوصات إعادة التشكيل في المختبر ، التي يتم إجراؤها بالاقتران مع الفحص المجهري الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF) ، على التحايل على تحديات فحص الآليات التي تنظم من خلالها مجموعات فرعية محددة من MAPs ديناميكيات صفائف الأنابيب الدقيقة الخلوية القريبة. هنا ، يتم فحص ديناميكيات الأنابيب الدقيقة التي يتم تجميعها في المختبر في وجود واحد أو أكثر من MAPs المؤتلفة في ظل ظروف خاضعة للرقابة8،9،10. ومع ذلك ، يتم إجراء اختبارات إعادة التشكيل التقليدية عادة على الأنابيب الدقيقة المفردة أو على نوع واحد من الصفيفات ، مما يحول دون تصور السكان المتعايشين.
هنا ، نقدم في المختبر اختبارات إعادة التشكيل التي تمكن من التصور المتزامن لمجموعتين من الأنابيب الدقيقة تحت نفس ظروف الحل 11. نحن نصف طريقة لعرض النشاط الجماعي ل MAPs متعددة في وقت واحد على الأنابيب الدقيقة المفردة وعلى حزم الأنابيب الدقيقة المترابطة بواسطة البروتين المرتبط بالمغزل الانقسامي PRC1. يرتبط البروتين PRC1 بشكل تفضيلي عند التداخل بين الأنابيب الدقيقة المضادة للتوازي ، ويربطها معا9. باختصار ، يتكون هذا البروتوكول من الخطوات التالية: (i) إعداد محاليل المخزون والكواشف ، (ii) تنظيف ومعالجة السطح للأغطية المستخدمة لإنشاء غرفة التصوير لتجارب الفحص المجهري ، (iii) إعداد “بذور” microtubule مستقرة والتي تبدأ منها البلمرة أثناء التجربة ، (iv) مواصفات إعدادات المجهر TIRF لتصور ديناميكيات microtubule ، (v) تجميد بذور microtubule وتوليد حزم microtubule المتشابكة في غرفة التصوير ، و (vi) تصور ديناميكيات الأنابيب الدقيقة في غرفة التصوير من خلال المجهر TIRF ، عند إضافة توبولين قابل للذوبان ، MAPs ، والنيوكليوتيدات. تمكن هذه الفحوصات من التقييم النوعي والفحص الكمي لتوطين MAP وتأثيرها على ديناميكيات مجموعتين من الأنابيب الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تسهل تقييم الآثار التآزرية ل MAPs المتعددة على مجموعات الأنابيب الدقيقة هذه ، عبر مجموعة واسعة من الظروف التجريبية.
توسع التجربة الموصوفة هنا بشكل كبير نطاق وتعقيد اختبارات إعادة تشكيل الأنابيب الدقيقة التقليدية ، والتي يتم إجراؤها تقليديا على الأنابيب الدقيقة المفردة أو على نوع واحد من الصفيف. يوفر الفحص الحالي طريقة لتحديد ومقارنة نشاط MAP التنظيمي في وقت واحد على مجموعتين سكانيتين ، وهما الأنابيب ا?…
The authors have nothing to disclose.
تم دعم هذا العمل من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة (رقم 1DP2GM126894-01) ، وبأموال من صناديق بيو الخيرية ومؤسسة عائلة سميث إلى R.S. يشكر المؤلفون الدكتور شو جيانغ على مساهمته في تطوير وتحسين البروتوكولات.
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) | Sigma Aldrich | 238813 | |
1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma Aldrich | P6757 | |
18×18 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63787 | |
2-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | M-6250 | |
24×60 mm #1.5 coverslips | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
405/488/560/647 nm Laser Quad Band | Chroma | TRF89901-NK | |
Acetone | Sigma Aldrich | 320110 | |
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma Aldrich | A7699-5G | |
Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®) | Thermo Fischer Scientific | A2666 | |
Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner | Branson | CPX2800H | |
Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343778 | |
Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm | Beckman-Coulter | 343776 | |
Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | Laysan Bio | #Biotin-PEG-SVA-5000 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | 2905 | |
Catalase | Sigma Aldrich | C40 | |
Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V | Corning | 6670 | |
Delicate Task Wipes | Kimtech | 34120 | |
Dithiothreitol (DTT) | GoldBio | DTT10 | |
Emission filter | Chroma | ET610/75m | |
Ethanol (200-proof) | Decon Labs | 2705 | |
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma Aldrich | 3777 | |
Glucose Oxidase | Sigma Aldrich | G2133 | |
GMPCPP | Jena Bioscience | NU-405 | |
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma Aldrich | G8877 | |
Hellmanex III detergent | Sigma Aldrich | Z805939 | |
Immersion oil, Type A | Fisher Scientific | 77010 | |
Kappa-casein | Sigma Aldrich | C0406 | |
Lanolin | Fisher Scientific | S25376 | |
Lens Cleaning Tissue | ThorLabs | MC-5 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma Aldrich | M9272 | |
Methylcellulose | Sigma Aldrich | M0512 | |
Microfuge 16 Benchtop Centrifuge | Beckman-Coulter | A46474 | |
Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted | Globe Scientific | 1380-50W | |
mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000 | Laysan Bio | #NH2-PEG-VA-5K | |
Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | 393315 | |
Paraffin | Fisher Scientific | P31-500 | |
PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers | Ted Pella | 5377-NM | |
Petrolatum, White | Fisher Scientific | 18-605-050 | |
Plasma Cleaner, 115V | Harrick Plasma | PDC-001 | |
Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014 | |
Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath | USA Scientific | 2510-1101 | |
Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes | USA Scientific | 2520-0000 | |
Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM | Thermo Fischer Scientific | PI-77720 | |
TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective | Nikon | CFI Apochromat TIRF 100XC Oil | |
TIRF microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
TLA 120.1 rotor | Beckman-Coulter | 362224 | |
TLA 120.2 rotor | Beckman-Coulter | 357656 | |
Tubulin protein (>99% pure): porcine brain | Cytoskeleton | T240 | |
Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain | Cytoskeleton | T333P | |
Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain | Cytoskeleton | TL670M | |
Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain | Cytoskeleton | TL620M | |
VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion | Vector Biolabs | SP-1800-7 | |
VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A | VWR | 97025-630 |