Summary

التصور المتزامن لديناميكيات الأنابيب الدقيقة المتقاطعة والمفردة في المختبر بواسطة مجهر TIRF

Published: February 18, 2022
doi:

Summary

هنا ، يتم تقديم فحص إعادة تشكيل مجهري TIRF قائم على المختبر لتحديد ومقارنة ديناميكيات مجموعتين من الأنابيب الدقيقة في وقت واحد. يتم وصف طريقة لعرض النشاط الجماعي للبروتينات المتعددة المرتبطة بالأنابيب الدقيقة في وقت واحد على حزم الأنابيب الدقيقة المتقاطعة والأنابيب الدقيقة المفردة.

Abstract

الأنابيب الدقيقة هي بوليمرات من αβ-tubulin heterodimers التي تنظم في هياكل متميزة في الخلايا. غالبا ما تحتوي المعماريات والشبكات القائمة على الأنابيب الدقيقة على مجموعات فرعية من صفائف الأنابيب الدقيقة التي تختلف في خصائصها الديناميكية. على سبيل المثال ، في تقسيم الخلايا ، تتعايش حزم مستقرة من الأنابيب الدقيقة المتقاطعة على مقربة من الأنابيب الدقيقة الديناميكية غير المترابطة. تمكن دراسات إعادة التشكيل في المختبر القائمة على TIRF المجهري من التصور المتزامن لديناميكيات هذه المصفوفات المختلفة من الأنابيب الدقيقة. في هذا الفحص ، يتم تجميع غرفة التصوير باستخدام الأنابيب الدقيقة المجمدة على السطح ، والتي إما موجودة كخيوط مفردة أو منظمة في حزم متقاطعة. يسمح إدخال التوبولين والنيوكليوتيدات ومنظمات البروتين بالتصور المباشر للبروتينات المرتبطة والخصائص الديناميكية للأنابيب الدقيقة المفردة والمتشابكة. علاوة على ذلك ، يمكن مراقبة التغييرات التي تحدث عندما يتم تنظيم الأنابيب الدقيقة المفردة الديناميكية في حزم في الوقت الفعلي. تسمح الطريقة الموصوفة هنا بإجراء تقييم منهجي لنشاط البروتينات الفردية وتوطينها ، بالإضافة إلى التأثيرات التآزرية لمنظمات البروتين على مجموعتين فرعيتين مختلفتين من الأنابيب الدقيقة في ظل ظروف تجريبية متطابقة ، وبالتالي توفير رؤى ميكانيكية لا يمكن الوصول إليها بطرق أخرى.

Introduction

الأنابيب الدقيقة هي بوليمرات حيوية تشكل سقالات هيكلية ضرورية لعمليات خلوية متعددة ، تتراوح من النقل داخل الخلايا وتحديد مواقع العضيات إلى انقسام الخلايا واستطالتها. لتنفيذ هذه الوظائف المتنوعة ، يتم تنظيم الأنابيب الدقيقة الفردية في صفائف بحجم ميكرون ، مثل المغزل الانقسامي ، والمحاور الهدبية ، والحزم العصبية ، والمصفوفات بين الأطوار ، والمصفوفات القشرية النباتية. ومن الزخارف المعمارية المنتشرة في كل مكان الموجودة في هذه الهياكل مجموعة من الأنابيب الدقيقة المتشابكة على طول أطوالها1. ومن السمات المثيرة للاهتمام للعديد من الهياكل القائمة على الأنابيب الدقيقة التعايش بين الأنابيب الدقيقة المجمعة والأنابيب الدقيقة المفردة غير المتقاطعة في مكان قريب. يمكن لهذه المجموعات الفرعية من الأنابيب الدقيقة أن تعرض ديناميكيات بلمرة مختلفة بشكل صارخ عن بعضها البعض ، حسب الحاجة لوظيفتها المناسبة2،3،4،5. على سبيل المثال، داخل المغزل الانقسامي، توجد حزم متقاطعة مستقرة وأنابيب دقيقة مفردة ديناميكية داخل منطقة على نطاق ميكرون في مركز الخلية6. وبالتالي ، فإن دراسة كيفية تحديد الخصائص الديناميكية لمجموعات الأنابيب الدقيقة المتعايشة أمر أساسي لفهم تجميع ووظيفة الهياكل القائمة على الأنابيب الدقيقة.

الأنابيب الدقيقة هي بوليمرات ديناميكية تدور بين مراحل البلمرة وإزالة البلمرة ، وتنتقل بين المرحلتين في الأحداث المعروفة باسم الكارثة والإنقاذ7. يتم تنظيم ديناميكيات الأنابيب الدقيقة الخلوية من خلال عدد لا يحصى من البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة (MAPs) التي تعدل معدلات بلمرة الأنابيب الدقيقة وإزالة البلمرة وترددات أحداث الكوارث والإنقاذ. ومن الصعب التحقيق في نشاط MAPs على المصفوفات القريبة مكانيا في الخلايا، بسبب محدودية الاستبانة المكانية في الفحص المجهري الضوئي، وخاصة في المناطق ذات الكثافة العالية للأنابيب الدقيقة. علاوة على ذلك ، فإن وجود MAPs متعددة في نفس المنطقة الخلوية يعيق تفسيرات الدراسات البيولوجية الخلوية. تعمل فحوصات إعادة التشكيل في المختبر ، التي يتم إجراؤها بالاقتران مع الفحص المجهري الكلي للانعكاس الداخلي (TIRF) ، على التحايل على تحديات فحص الآليات التي تنظم من خلالها مجموعات فرعية محددة من MAPs ديناميكيات صفائف الأنابيب الدقيقة الخلوية القريبة. هنا ، يتم فحص ديناميكيات الأنابيب الدقيقة التي يتم تجميعها في المختبر في وجود واحد أو أكثر من MAPs المؤتلفة في ظل ظروف خاضعة للرقابة8،9،10. ومع ذلك ، يتم إجراء اختبارات إعادة التشكيل التقليدية عادة على الأنابيب الدقيقة المفردة أو على نوع واحد من الصفيفات ، مما يحول دون تصور السكان المتعايشين.

هنا ، نقدم في المختبر اختبارات إعادة التشكيل التي تمكن من التصور المتزامن لمجموعتين من الأنابيب الدقيقة تحت نفس ظروف الحل 11. نحن نصف طريقة لعرض النشاط الجماعي ل MAPs متعددة في وقت واحد على الأنابيب الدقيقة المفردة وعلى حزم الأنابيب الدقيقة المترابطة بواسطة البروتين المرتبط بالمغزل الانقسامي PRC1. يرتبط البروتين PRC1 بشكل تفضيلي عند التداخل بين الأنابيب الدقيقة المضادة للتوازي ، ويربطها معا9. باختصار ، يتكون هذا البروتوكول من الخطوات التالية: (i) إعداد محاليل المخزون والكواشف ، (ii) تنظيف ومعالجة السطح للأغطية المستخدمة لإنشاء غرفة التصوير لتجارب الفحص المجهري ، (iii) إعداد “بذور” microtubule مستقرة والتي تبدأ منها البلمرة أثناء التجربة ، (iv) مواصفات إعدادات المجهر TIRF لتصور ديناميكيات microtubule ، (v) تجميد بذور microtubule وتوليد حزم microtubule المتشابكة في غرفة التصوير ، و (vi) تصور ديناميكيات الأنابيب الدقيقة في غرفة التصوير من خلال المجهر TIRF ، عند إضافة توبولين قابل للذوبان ، MAPs ، والنيوكليوتيدات. تمكن هذه الفحوصات من التقييم النوعي والفحص الكمي لتوطين MAP وتأثيرها على ديناميكيات مجموعتين من الأنابيب الدقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تسهل تقييم الآثار التآزرية ل MAPs المتعددة على مجموعات الأنابيب الدقيقة هذه ، عبر مجموعة واسعة من الظروف التجريبية.

Protocol

1. إعداد الكواشف إعداد المخازن المؤقتة والكواشف على النحو المبين في الجدول 1 والجدول 2. أثناء التجربة ، احتفظ بجميع الحلول على الجليد ، ما لم يذكر خلاف ذلك. حل مكونات</s…

Representative Results

تم إجراء التجربة الموصوفة أعلاه باستخدام أنابيب دقيقة بيوتينيل تحمل علامة الفلوروفور 647 نانومتر ، وأنابيب دقيقة غير بيوتينيل تحمل علامة الفلوروفور 560 نانومتر ، ومزيج توبولين قابل للذوبان يحمل علامة الفلوروفور 560 نانومتر. تم ربط الأنابيب الدقيقة بواسطة بروتين الربط المتقاطع PRC1 (المسمى GFP)….

Discussion

توسع التجربة الموصوفة هنا بشكل كبير نطاق وتعقيد اختبارات إعادة تشكيل الأنابيب الدقيقة التقليدية ، والتي يتم إجراؤها تقليديا على الأنابيب الدقيقة المفردة أو على نوع واحد من الصفيف. يوفر الفحص الحالي طريقة لتحديد ومقارنة نشاط MAP التنظيمي في وقت واحد على مجموعتين سكانيتين ، وهما الأنابيب ا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منحة من المعاهد الوطنية للصحة (رقم 1DP2GM126894-01) ، وبأموال من صناديق بيو الخيرية ومؤسسة عائلة سميث إلى R.S. يشكر المؤلفون الدكتور شو جيانغ على مساهمته في تطوير وتحسين البروتوكولات.

Materials

(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) Sigma Aldrich 238813
1,4-piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) Sigma Aldrich P6757
18×18 mm #1.5 coverslips  Electron Microscopy Sciences 63787
2-Mercaptoethanol (BME) Sigma Aldrich M-6250
24×60 mm #1.5 coverslips Electron Microscopy Sciences 63793
405/488/560/647 nm Laser Quad Band  Chroma TRF89901-NK
Acetone Sigma Aldrich 320110
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) Sigma Aldrich A7699-5G
Avidin, NeutrAvidin® Biotin-binding Protein (Molecular Probes®) Thermo Fischer Scientific A2666
Bath sonicator: Branson 2800 Cleaner Branson CPX2800H
Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 11 x 34 mm Beckman-Coulter  343778
Beckman Coulter Polycarbonate Thickwall Tubes, 8 x 34 mm Beckman-Coulter  343776
Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 Laysan Bio #Biotin-PEG-SVA-5000
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma Aldrich 2905
Catalase Sigma Aldrich C40
Corning LSE Mini Microcentrifuge, AC100-240V Corning 6670
Delicate Task Wipes Kimtech 34120
Dithiothreitol (DTT) GoldBio DTT10
Emission filter Chroma ET610/75m
Ethanol (200-proof) Decon Labs 2705
Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) Sigma Aldrich 3777
Glucose Oxidase Sigma Aldrich G2133
GMPCPP Jena Bioscience  NU-405
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) Sigma Aldrich G8877
Hellmanex III detergent  Sigma Aldrich Z805939
Immersion oil, Type A Fisher Scientific 77010
Kappa-casein Sigma Aldrich C0406
Lanolin Fisher Scientific S25376
Lens Cleaning Tissue ThorLabs MC-5
Magnesium Chloride (MgCl2) Sigma Aldrich M9272
Methylcellulose Sigma Aldrich M0512
Microfuge 16 Benchtop Centrifuge Beckman-Coulter  A46474
Microscope Slides, Diamond White Glass, 25 x 75mm, 90° Ground Edges, WHITE Frosted Globe Scientific 1380-50W
mPEG-Succinimidyl Valerate, MW 5,000  Laysan Bio #NH2-PEG-VA-5K
Optima™ Max-XP Tabletop Ultracentrifuge Beckman-Coulter  393315
Paraffin Fisher Scientific P31-500
PELCO Reverse (self-closing), Fine Tweezers Ted Pella 5377-NM
Petrolatum, White Fisher Scientific 18-605-050
Plasma Cleaner, 115V Harrick Plasma PDC-001
Potassium Hydroxide (KOH) Sigma Aldrich 221473
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6014
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Thermal-Lok 1-Position Dry Heat Bath USA Scientific 2510-1101
Thermal-Lok Block for 1.5 and 2.0 mL Tubes USA Scientific 2520-0000
Thermo Scientific™ Pierce™ Bond-Breaker™ TCEP Solution, Neutral pH; 500mM Thermo Fischer Scientific PI-77720
TIRF 100X NA 1.49 Oil Objective Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil
TIRF microscope Nikon Eclipse Ti
TLA 120.1 rotor Beckman-Coulter  362224
TLA 120.2 rotor Beckman-Coulter  357656
Tubulin protein (>99% pure): porcine brain Cytoskeleton T240
Tubulin Protein (Biotin): Porcine Brain Cytoskeleton T333P
Tubulin protein (fluorescent HiLyte 647): porcine brain Cytoskeleton TL670M
Tubulin protein (X-rhodamine): bovine brain Cytoskeleton TL620M
VECTABOND® Reagent, Tissue Section Adhesion Vector Biolabs SP-1800-7
VWR® Personal-Sized Incubator, 120V, 50/60Hz, 0.6A VWR 97025-630

References

  1. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  2. Baas, P. W., Rao, A. N., Matamoros, A. J., Leo, L. Stability properties of neuronal microtubules. Cytoskeleton (Hoboken). 73 (9), 442-460 (2016).
  3. Bitan, A., Rosenbaum, I., Abdu, U. Stable and dynamic microtubules coordinately determine and maintain Drosophila bristle shape. Development. 139 (11), 1987-1996 (2012).
  4. Foe, V. E., von Dassow, G. Stable and dynamic microtubules coordinately shape the myosin activation zone during cytokinetic furrow formation. The Journal of Cell Biology. 183 (3), 457-470 (2008).
  5. Pous, C., et al. Functional specialization of stable and dynamic microtubules in protein traffic in WIF-B cells. The Journal of Cell Biology. 142 (1), 153-165 (1998).
  6. Uehara, R., Goshima, G. Functional central spindle assembly requires de novo microtubule generation in the interchromosomal region during anaphase. The Journal of Cell Biology. 191 (2), 259-267 (2010).
  7. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312 (5991), 237-242 (1984).
  8. Bieling, P., et al. Reconstitution of a microtubule plus-end tracking system in vitro. Nature. 450 (7172), 1100-1105 (2007).
  9. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  10. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of Kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  11. Mani, N., Jiang, S., Neary, A. E., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Differential regulation of single microtubules and bundles by a three-protein module. Nature Chemical Biology. 17 (9), 964-974 (2021).
  12. Hyman, A. A., Salser, S., Drechsel, D., Unwin, N., Mitchison, T. J. Role of GTP hydrolysis in microtubule dynamics: information from a slowly hydrolyzable analogue, GMPCPP. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1155-1167 (1992).
  13. Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
  14. Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging. Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).
  15. Wijeratne, S., Subramanian, R. Geometry of antiparallel microtubule bundles regulates relative sliding and stalling by PRC1 and Kif4A. eLife. 7, 32595 (2018).
  16. Mani, N., Wijeratne, S. S., Subramanian, R. Micron-scale geometrical features of microtubules as regulators of microtubule organization. eLife. 10, 63880 (2021).
  17. Freal, A., et al. Feedback-driven assembly of the axon initial segment. Neuron. 104 (2), 305-321 (2019).
  18. Ledbetter, M., Porter, K. A "microtubule" in plant cell fine structure. The Journal of Cell Biology. 19 (1), 239-250 (1963).
  19. Wijeratne, S. S., Marchan, M. F., Tresback, J. S., Subramanian, R. Atomic force microscopy reveals distinct protofilament-scale structural dynamics in depolymerizing microtubule arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 119 (2022).

Play Video

Cite This Article
Mani, N., Marchan, M. F., Subramanian, R. Simultaneous Visualization of the Dynamics of Crosslinked and Single Microtubules In Vitro by TIRF Microscopy. J. Vis. Exp. (180), e63377, doi:10.3791/63377 (2022).

View Video