Visualisation simultanée de la dynamique des microtubules réticulés et simples in vitro par microscopie TIRF

Les microtubules sont des biopolymères qui forment des échafaudages structurels essentiels à de multiples processus cellulaires, allant du transport intracellulaire et du positionnement des organites à la division cellulaire et à l’allongement. Pour exécuter ces diverses fonctions, les microtubules individuels sont organisés en réseaux de la taille d’un micron, tels que les fuseaux mitotiques, les axonèmes ciliaires, les faisceaux neuronaux, les réseaux interphasiques et les réseaux corticaux végétaux. Un motif architectural omniprésent que l’on retrouve dans ces structures est un faisceau de microtubules réticulés sur toute leur ^longueur1. Une caractéristique intrigante de plusieurs structures à base de microtubules est la coexistence de microtubules groupés et de microtubules simples non réticulés à proximité spatiale étroite. Ces sous-populations de microtubules peuvent présenter une dynamique de polymérisation très différente les unes des autres, selon les besoins pour leur bon ^{fonctionnement2,3,4,5}. Par exemple, dans le fuseau mitotique, des faisceaux réticulés stables et des microtubules simples dynamiques sont présents dans une région à l’échelle du micron au centre ^cellulaire6. L’étude de la façon dont les propriétés dynamiques des populations de microtubules coexistantes sont spécifiées est donc essentielle pour comprendre l’assemblage et la fonction des structures à base de microtubules.

Les microtubules sont des polymères dynamiques qui alternent entre les phases de polymérisation et de dépolymérisation, passant d’une phase à l’autre dans des événements connus sous le nom de catastrophe et de ^sauvetage7. La dynamique des microtubules cellulaires est régulée par une myriade de protéines associées aux microtubules (MAP) qui modulent les taux de polymérisation et de dépolymérisation des microtubules et les fréquences des catastrophes et des événements de sauvetage. Il est difficile d’étudier l’activité des MAP sur les réseaux proximaux spatiaux dans les cellules, en raison des limites de la résolution spatiale en microscopie optique, en particulier dans les régions à haute densité de microtubules. De plus, la présence de plusieurs MAP dans la même région cellulaire entrave l’interprétation des études biologiques cellulaires. Les essais de reconstitution in vitro, effectués conjointement avec la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF), contournent les défis liés à l’examen des mécanismes par lesquels des sous-ensembles spécifiques de MAP régulent la dynamique des réseaux de microtubules cellulaires proximaux. Ici, la dynamique des microtubules assemblés in vitro est examinée en présence d’un ou plusieurs MAP recombinants dans des conditions contrôlées8,9,10. Cependant, les essais de reconstitution conventionnels sont généralement effectués sur des microtubules simples ou sur un type de réseau, empêchant la visualisation de populations coexistantes.

Nous présentons ici des essais de reconstitution in vitro qui permettent la visualisation simultanée de deux populations de microtubules dans les mêmes conditions ^{de solution11}. Nous décrivons une méthode permettant de visualiser simultanément l’activité collective de plusieurs MAP sur des microtubules simples et sur des faisceaux de microtubules réticulés par la protéine mitotique associée au fuseau PRC1. La protéine PRC1 se lie préférentiellement au chevauchement entre les microtubules anti-parallèles, les réticulant9. En bref, ce protocole comprend les étapes suivantes: (i) préparation de solutions mères et de réactifs, (ii) nettoyage et traitement de surface des couvercles utilisés pour créer la chambre d’imagerie pour les expériences de microscopie, (iii) préparation de « graines » de microtubules stables à partir desquelles la polymérisation est initiée au cours de l’expérience, (iv) spécification des paramètres du microscope TIRF pour visualiser la dynamique des microtubules, (v) immobilisation des graines de microtubules et génération de faisceaux de microtubules réticulés dans la chambre d’imagerie, et (vi) visualisation de la dynamique des microtubules dans la chambre d’imagerie par microscopie TIRF, après addition de tubuline soluble, de MAP et de nucléotides. Ces essais permettent l’évaluation qualitative et l’examen quantitatif de la localisation de la MAP et de son effet sur la dynamique de deux populations de microtubules. En outre, ils facilitent l’évaluation des effets synergiques de plusieurs MAP sur ces populations de microtubules, dans un large éventail de conditions expérimentales.