Visualizzazione simultanea della dinamica di microtubuli reticolati e singoli in vitro mediante microscopia TIRF

I microtubuli sono biopolimeri che formano scaffold strutturali essenziali per molteplici processi cellulari, che vanno dal trasporto intracellulare e dal posizionamento degli organelli alla divisione cellulare e all’allungamento. Per eseguire queste diverse funzioni, i singoli microtubuli sono organizzati in array di dimensioni micron, come fusi mitotici, assonemi ciliari, fasci neuronali, array interfase e array corticali vegetali. Un motivo architettonico onnipresente trovato in queste strutture è un fascio di microtubuli reticolati lungo le loro ^lunghezze1. Una caratteristica intrigante di diverse strutture a base di microtubuli è la coesistenza di microtubuli raggruppati e singoli microtubuli non reticolati in stretta vicinanza spaziale. Queste sottopopolazioni di microtubuli possono mostrare dinamiche di polimerizzazione nettamente diverse l’una dall’altra, come necessario per il loro corretto ^{funzionamento2,3,4,5}. Ad esempio, all’interno del fuso mitotico, fasci reticolati stabili e singoli microtubuli dinamici sono presenti all’interno di una regione su scala micron al centro ^cellulare6. Studiare come vengono specificate le proprietà dinamiche delle popolazioni di microtubuli coesistenti è, quindi, fondamentale per comprendere l’assemblaggio e la funzione delle strutture basate sui microtubuli.

I microtubuli sono polimeri dinamici che si alternano tra le fasi di polimerizzazione e depolimerizzazione, passando da una fase all’altra in eventi noti come catastrofe e ^salvataggio7. La dinamica dei microtubuli cellulari è regolata da una miriade di Microtubule Associated Proteins (MAP) che modulano i tassi di polimerizzazione e depolimerizzazione dei microtubuli e le frequenze degli eventi catastrofici e di soccorso. È difficile studiare l’attività delle MAP su array spazialmente prossimali nelle cellule, a causa dei limiti della risoluzione spaziale nella microscopia ottica, specialmente nelle regioni ad alta densità di microtubuli. Inoltre, la presenza di più MAP nella stessa regione cellulare ostacola le interpretazioni degli studi biologici cellulari. I saggi di ricostituzione in vitro, eseguiti in combinazione con la microscopia TIRF (Total Internal Reflection Fluorescence), aggirano le sfide dell’esame dei meccanismi con cui specifici sottoinsiemi di MAP regolano la dinamica degli array di microtubuli cellulari prossimali. Qui, la dinamica dei microtubuli assemblati in vitro viene esaminata in presenza di una o più MAP ricombinanti in condizioni controllate8,9,10. Tuttavia, i saggi di ricostituzione convenzionali vengono tipicamente eseguiti su singoli microtubuli o su un tipo di array, precludendo la visualizzazione di popolazioni coesistenti.

Qui presentiamo saggi di ricostituzione in vitro che consentono la visualizzazione simultanea di due popolazioni di microtubuli nelle stesse condizioni di ^soluzione11. Descriviamo un metodo per visualizzare simultaneamente l’attività collettiva di più MAP su singoli microtubuli e su fasci di microtubuli reticolati dalla proteina PRC1 associata al fuso mitotico. La proteina PRC1 si lega preferenzialmente alla sovrapposizione tra microtubuli antiparalleli, reticolandoli9. In breve, questo protocollo consiste nelle seguenti fasi: (i) preparazione di soluzioni stock e reagenti, (ii) pulizia e trattamento superficiale dei coverslip utilizzati per creare la camera di imaging per esperimenti di microscopia, (iii) preparazione di “semi” di microtubuli stabili da cui viene avviata la polimerizzazione durante l’esperimento, (iv) specifica delle impostazioni del microscopio TIRF per visualizzare la dinamica dei microtubuli, (v) immobilizzazione dei semi di microtubuli e generazione di fasci di microtubuli reticolati nella camera di imaging e (vi) visualizzazione della dinamica dei microtubuli nella camera di imaging attraverso la microscopia TIRF, previa aggiunta di tubulina solubile, MAP e nucleotidi. Questi saggi consentono la valutazione qualitativa e l’esame quantitativo della localizzazione MAP e del loro effetto sulla dinamica di due popolazioni di microtubuli. Inoltre, facilitano la valutazione degli effetti sinergici di più MAP su queste popolazioni di microtubuli, in una vasta gamma di condizioni sperimentali.