Одновременная визуализация динамики сшитых и одиночных микротрубочек in vitro методом TIRF-микроскопии

Микротрубочки представляют собой биополимеры, которые образуют структурные каркасы, необходимые для нескольких клеточных процессов, начиная от внутриклеточного транспорта и позиционирования органелл до деления и удлинения клеток. Для выполнения этих разнообразных функций отдельные микротрубочки организованы в массивы размером с микрон, такие как митотические веретена, цилиарные аксонемы, пучки нейронов, межфазные массивы и растительные корковые массивы. Вездесущим архитектурным мотивом, найденным в этих структурах, является пучок микротрубочек, сшитых по их ^длине1. Интригующей особенностью нескольких структур на основе микротрубочек является сосуществование пучковых микротрубочек и несшитых одиночных микротрубочек в непосредственной пространственной близости. Эти субпопуляции микротрубочек могут демонстрировать резко отличающуюся динамику полимеризации друг от друга, как это необходимо для их правильного функционирования2,3,4,5. Например, внутри митотического шпинделя стабильные сшитые пучки и динамические одиночные микротрубочки присутствуют в микронной области в центре ^{ячейки6}. Таким образом, изучение того, как определяются динамические свойства сосуществующих популяций микротрубочек, имеет решающее значение для понимания сборки и функции структур на основе микротрубочек.

Микротрубочки представляют собой динамические полимеры, которые циклически переключаются между фазами полимеризации и деполимеризации, переключаясь между двумя фазами в событиях, известных как катастрофа и ^{спасение7}. Динамика клеточных микротрубочек регулируется мириадами микротрубочек,ассоциированных белков (MAP), которые модулируют скорость полимеризации и деполимеризации микротрубочек и частоты катастроф и спасательных событий. Исследовать активность MAP на пространственно проксимальных массивах в клетках сложно из-за ограничений пространственного разрешения в световой микроскопии, особенно в областях с высокой плотностью микротрубочек. Более того, наличие нескольких MAP в одной и той же клеточной области затрудняет интерпретацию клеточных биологических исследований. Анализы восстановления in vitro, выполняемые в сочетании с микроскопией полной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF), обходят проблемы изучения механизмов, с помощью которых конкретные подмножества MAP регулируют динамику проксимальных клеточных микротрубочек. Здесь исследуется динамика собранных in vitro микротрубочек в присутствии одного или нескольких рекомбинантных MAP в контролируемых условиях8,9,10. Однако обычные анализы восстановления обычно выполняются на одиночных микротрубочках или на одном типе массива, что исключает визуализацию сосуществующих популяций.

Здесь мы представляем анализы восстановления in vitro , которые позволяют одновременно визуализировать две популяции микротрубочек в одних и тех же условиях ^{решения11}. Описан способ одновременного просмотра коллективной активности нескольких MAP на одиночных микротрубочках и на пучках микротрубочек, сшитых митотическим веретенно-ассоциированным белком PRC1. Белок PRC1 преимущественно связывается при перекрытии между антипараллельными микротрубочками, сшивая ^их9. Вкратце, этот протокол состоит из следующих этапов: (i) подготовка исходных растворов и реагентов, (ii) очистка и обработка поверхности покровных пластин, используемых для создания камеры визуализации для микроскопических экспериментов, (iii) подготовка стабильных «семян» микротрубочек, из которых полимеризация инициируется в ходе эксперимента, (iv) спецификация настроек микроскопа TIRF для визуализации динамики микротрубочек, (v) иммобилизация семян микротрубочек и генерация сшитых пучков микротрубочек в камере визуализации и (vi) визуализация динамики микротрубочек в камере визуализации с помощью микроскопии TIRF при добавлении растворимого тубулина, MAP и нуклеотидов. Эти анализы позволяют качественно оценить и количественно изучить локализацию MAP и их влияние на динамику двух популяций микротрубочек. Кроме того, они облегчают оценку синергетического воздействия нескольких MAP на эти популяции микротрубочек в широком диапазоне экспериментальных условий.