Gelijktijdige visualisatie van de dynamica van crosslinked en enkele microtubuli in vitro door TIRF-microscopie

Microtubuli zijn biopolymeren die structurele steigers vormen die essentieel zijn voor meerdere cellulaire processen, variërend van intracellulair transport en organelpositionering tot celdeling en elongatie. Om deze diverse functies uit te voeren, worden individuele microtubuli georganiseerd in arrays ter grootte van micron, zoals mitotische spindels, ciliaire axonemen, neuronale bundels, interfase-arrays en plantaardige corticale arrays. Een alomtegenwoordig architectonisch motief dat in deze structuren wordt aangetroffen, is een bundel microtubuli die over hun lengtes zijn ^verknoopt1. Een intrigerend kenmerk van verschillende op microtubuli gebaseerde structuren is het naast elkaar bestaan van gebundelde microtubuli en niet-verknoopte enkele microtubuli in de nabijheid van ruimte. Deze subpopulaties van microtubuli kunnen sterk verschillende polymerisatiedynamieken van elkaar vertonen, afhankelijk van wat nodig is voor hun juiste functie2,3,4,5. Binnen de mitotische spil zijn bijvoorbeeld stabiele verknoopte bundels en dynamische enkele microtubuli aanwezig in een micronschaalgebied in het ^celcentrum6. Het bestuderen van hoe de dynamische eigenschappen van naast elkaar bestaande microtubulipopulaties worden gespecificeerd, is daarom van cruciaal belang voor het begrijpen van de assemblage en functie van op microtubulen gebaseerde structuren.

Microtubuli zijn dynamische polymeren die fietsen tussen fasen van polymerisatie en depolymerisatie, waarbij wordt geschakeld tussen de twee fasen in gebeurtenissen die bekend staan als catastrofe en ^redding7. De dynamiek van cellulaire microtubuli wordt gereguleerd door talloze Microtubule Associated Proteins (MAPs) die de snelheden van microtubule polymerisatie en depolymerisatie en de frequenties van catastrofe- en reddingsgebeurtenissen moduleren. Het is een uitdaging om de activiteit van MAPs op ruimtelijk proximale arrays in cellen te onderzoeken, vanwege de beperkingen van de ruimtelijke resolutie in lichtmicroscopie, vooral in regio’s met een hoge microtubuledichtheid. Bovendien belemmert de aanwezigheid van meerdere MAPs in hetzelfde cellulaire gebied de interpretaties van celbiologische studies. In vitro reconstitutietests, uitgevoerd in combinatie met Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie, omzeilen de uitdagingen van het onderzoeken van mechanismen waarmee specifieke subsets van MAPs de dynamiek van proximale cellulaire microtubule-arrays reguleren. Hier wordt de dynamiek van in vitro geassembleerde microtubuli onderzocht in aanwezigheid van een of meer recombinante MAPs onder gecontroleerde omstandigheden8,9,10. Conventionele reconstitutietests worden echter meestal uitgevoerd op enkele microtubuli of op één type array, waardoor de visualisatie van naast elkaar bestaande populaties wordt uitgesloten.

Hier presenteren we in vitro reconstitutietests die de gelijktijdige visualisatie van twee microtubulipopulaties onder dezelfde oplossingsomstandigheden mogelijk ^maken11. We beschrijven een methode om tegelijkertijd de collectieve activiteit van meerdere MAPs op enkele microtubuli en op microtubulibundels te bekijken die zijn gekruist door het mitotische spindel-geassocieerde eiwit PRC1. Het eiwit PRC1 bindt bij voorkeur aan de overlap tussen anti-parallelle microtubuli, waardoor ze worden ^verknoopt9. In het kort bestaat dit protocol uit de volgende stappen: (i) voorbereiding van stamoplossingen en reagentia, (ii) reiniging en oppervlaktebehandeling van coverslips die worden gebruikt om de beeldvormingskamer voor microscopie-experimenten te creëren, (iii) voorbereiding van stabiele microtubuli “zaden” van waaruit polymerisatie wordt gestart tijdens het experiment, (iv) specificatie van TIRF-microscoopinstellingen om microtubulidynamica te visualiseren, (v) immobilisatie van microtubulizaden en generatie van verknoopte microtubulibundels in de beeldvormingskamer, en (vi) visualisatie van microtubuledynamica in de beeldvormingskamer door middel van TIRF-microscopie, na toevoeging van oplosbare tubuline, MAPs en nucleotiden. Deze assays maken de kwalitatieve evaluatie en kwantitatief onderzoek van MAP-lokalisatie en hun effect op de dynamiek van twee microtubulepopulaties mogelijk. Bovendien vergemakkelijken ze de evaluatie van synergetische effecten van meerdere MAPs op deze microtubule-populaties, in een breed scala van experimentele omstandigheden.