TIRF顕微鏡による インビトロでの 架橋小管と単一微小管のダイナミクスの同時可視化

微小管は、細胞内輸送および細胞小器官の位置決めから細胞分裂および伸長に至るまで、複数の細胞プロセスに不可欠な構造足場を形成する生体高分子である。これらの多様な機能を実行するために、個々の微小管は、有糸分裂紡錘体、毛様体軸索、ニューロンバンドル、相間配列、および植物皮質配列などのミクロンサイズの配列に編成される。これらの構造に見られる普遍的な建築モチーフは、その長さに沿って架橋された微小管の束です¹。いくつかの微小管ベースの構造の興味深い特徴は、束ねられた微小管と非架橋された単一の微小管が空間的に近接して共存することである。これらの微小管亜集団は、その適切な機能のために必要なように、互いに著しく異なる重合ダイナミクスを示すことができる^2,3,4,5。例えば、有糸分裂紡錘体内では、安定な架橋束および動的単一微小管が、細胞中心のミクロンスケール領域内^{に存在する6}。したがって、共存する微小管集団の動的特性がどのように特定されるかを研究することは、微小管ベースの構造の組み立てと機能を理解する上で中心的である。

微小管は、重合と解重合の相を循環する動的なポリマーであり、大惨事と救助として知られるイベントで2つの相を切り替え^ます7。細胞微小管のダイナミクスは、微小管の重合および解重合の速度、ならびに大惨事および救助事象の頻度を調節する無数の微小管関連タンパク質(MAP)によって調節される。細胞内の空間的に近位アレイ上のMAPの活性を調べることは、光学顕微鏡、特に微小管密度の高い領域における空間分解能の限界のために困難である。さらに、同じ細胞領域に複数のMAPが存在することは、細胞生物学的研究の解釈を妨げる。全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡法と組み合わせて実施されるインビトロ再構成アッセイは、MAPの特定のサブセットが近位細胞微小管アレイのダイナミクスを調節するメカニズムを調べるという課題を回避します。ここで、インビトロで組み立てられた微小管の動態は、制御された条件下で1つ以上の組換えMAPの存在下で調べられる⁸、^9、10。 しかしながら、従来の再構成アッセイは、典型的には、単一の微小管または1つのタイプのアレイ上で行われ、共存する集団の可視化を妨げる。

ここでは、同じ溶液条件下で2つの微小管集団を同時に可視化することを可能にするin vitro 再構成アッセイ^{を紹介します11}。我々は、単一の微小管および有糸分裂紡錘体関連タンパク質PRC1によって架橋された微小管束上の複数のMAPの集合活性を同時に見る方法を説明する。タンパク質PRC1は、抗平行微小管間の重なりで優先的に結合し、それらを架橋する⁹。簡単に言えば、このプロトコルは、(i)原液および試薬の調製、(ii)顕微鏡実験用のイメージングチャンバの作成に使用されるカバースリップの洗浄および表面処理、(iii)実験中に重合が開始される安定した微小管「種子」の調製、(iv)微小管ダイナミクスを視覚化するためのTIRF顕微鏡設定の仕様、(v)微小管種子の固定化および架橋微小管束の生成 画像化チャンバ内において、(vi)TIRF顕微鏡による画像化チャンバ内の微小管ダイナミクスの可視化、可溶性チューブリン、MAP、およびヌクレオチドの添加時。これらのアッセイは、MAP局在化および2つの微小管集団の動態に対するそれらの影響の定性的評価および定量的検査を可能にする。さらに、これらの微小管集団に対する複数のMAPの相乗効果の評価を、幅広い実験条件にわたって容易にする。