Simultane Visualisierung der Dynamik von vernetzten und einzelnen Mikrotubuli in vitro mittels TIRF-Mikroskopie

Mikrotubuli sind Biopolymere, die strukturelle Gerüste bilden, die für mehrere zelluläre Prozesse unerlässlich sind, vom intrazellulären Transport und der Organellenpositionierung bis hin zur Zellteilung und -dehnung. Um diese vielfältigen Funktionen auszuführen, sind einzelne Mikrotubuli in mikrometergroße Arrays organisiert, wie z.B. mitotische Spindeln, Ziliaraxoneme, neuronale Bündel, Interphasenarrays und pflanzliche kortikale Arrays. Ein allgegenwärtiges architektonisches Motiv, das in diesen Strukturen zu finden ist, ist ein Bündel von Mikrotubuli, die entlang ihrer Länge miteinander verbunden ^sind1. Ein faszinierendes Merkmal mehrerer Mikrotubuli-basierter Strukturen ist die Koexistenz von gebündelten Mikrotubuli und nicht vernetzten Einzelmikrotubuli in unmittelbarer räumlicher Nähe. Diese Mikrotubuli-Subpopulationen können eine stark unterschiedliche Polymerisationsdynamik aufweisen, die für ihre ordnungsgemäße Funktion erforderlich ist2,3,4,5. Zum Beispiel sind innerhalb der mitotischen Spindel stabile vernetzte Bündel und dynamische einzelne Mikrotubuli innerhalb einer mikrometerskaligen Region im Zellzentrum ^vorhanden6. Die Untersuchung, wie die dynamischen Eigenschaften koexistierender Mikrotubulipopulationen spezifiziert werden, ist daher von zentraler Bedeutung für das Verständnis des Aufbaus und der Funktion von Mikrotubuli-basierten Strukturen.

Mikrotubuli sind dynamische Polymere, die zwischen Phasen der Polymerisation und Depolymerisation wechseln und zwischen den beiden Phasen in Ereignissen, die als Katastrophe und Rettung bekannt ^sind7 wechseln. Die Dynamik zellulärer Mikrotubuli wird durch unzählige Mikrotubuli-assoziierte Proteine (MAPs) reguliert, die die Raten der Mikrotubuli-Polymerisation und -Depolymerisation sowie die Häufigkeit von Katastrophen- und Rettungsereignissen modulieren. Es ist eine Herausforderung, die Aktivität von MAPs auf räumlich proximalen Arrays in Zellen zu untersuchen, da die räumliche Auflösung in der Lichtmikroskopie begrenzt ist, insbesondere in Regionen mit hoher Mikrotubulidichte. Darüber hinaus behindert das Vorhandensein mehrerer MAPs in derselben Zellregion die Interpretation zellbiologischer Studien. In-vitro-Rekonstitutionstests, die in Verbindung mit der TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflection Fluorescence) durchgeführt werden, umgehen die Herausforderungen der Untersuchung von Mechanismen, mit denen bestimmte Untergruppen von MAPs die Dynamik proximaler zellulärer Mikrotubuli-Arrays regulieren. Hier wird die Dynamik von in vitro zusammengesetzten Mikrotubuli in Gegenwart eines oder mehrerer rekombinanter MAPs unter kontrollierten Bedingungen untersucht8,9,10. Konventionelle Rekonstitutionsassays werden jedoch typischerweise an einzelnen Mikrotubuli oder an einer Art von Array durchgeführt, was die Visualisierung koexistierender Populationen ausschließt.

Hier stellen wir in vitro Rekonstitutionsassays vor, die die gleichzeitige Visualisierung von zwei Mikrotubulipopulationen unter den gleichen Lösungsbedingungen ^{ermöglichen11}. Wir beschreiben eine Methode, um gleichzeitig die kollektive Aktivität mehrerer MAPs auf einzelnen Mikrotubuli und auf Mikrotubulibündeln zu betrachten, die mit dem mitotischen Spindel-assoziierten Protein PRC1 vernetzt sind. Das Protein PRC1 bindet bevorzugt an der Überlappung zwischen antiparallelen Mikrotubuli und vernetzt ^sie9. Kurz gesagt, dieses Protokoll besteht aus den folgenden Schritten: (i) Herstellung von Stammlösungen und Reagenzien, (ii) Reinigung und Oberflächenbehandlung von Deckgläsern, die zur Herstellung der Bildgebungskammer für Mikroskopieexperimente verwendet werden, (iii) Herstellung stabiler Mikrotubuli-“Samen”, von denen während des Experiments eine Polymerisation eingeleitet wird, (iv) Spezifikation von TIRF-Mikroskopeinstellungen zur Visualisierung der Mikrotubuli-Dynamik, (v) Immobilisierung von Mikrotubuli-Samen und Erzeugung von vernetzten Mikrotubuli-Bündeln in der Bildgebungskammer und (vi) Visualisierung der Mikrotubulidynamik in der Bildgebungskammer durch TIRF-Mikroskopie unter Zugabe von löslichem Tubulin, MAPs und Nukleotiden. Diese Assays ermöglichen die qualitative Bewertung und quantitative Untersuchung der MAP-Lokalisierung und ihrer Wirkung auf die Dynamik zweier Mikrotubuli-Populationen. Darüber hinaus erleichtern sie die Bewertung der synergistischen Effekte mehrerer MAPs auf diese Mikrotubulipopulationen unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen.