이 프로토콜은 필드의 천연 기판에서 살아있는 선충을 효율적으로 추출하는 방법을 간략하게 설명합니다.
견고한 실험 모델 유기체인 것 외에도 , Caenorhabditis elegans 와 그 친척은 또한 자연에 사는 실제 동물입니다. 그들의 자연 환경에서 야생 선충의 연구는 생물학의 많은 측면을 이해 에 대 한 귀중 한, 독특한 게놈과 현상 전 형 문자 진화 하는 선택적 정권을 포함 하 여, 복잡 한 특성 변화에 대 한 유전 기초, 그리고 모든 동물 인구에 기본 자연 유전 다양성. 이 원고는 썩어가는 과일, 꽃, 곰팡이, 잎 쓰레기 및 토양을 포함하여 자연 기판에서 선충을 추출하는 간단하고 효율적인 방법을 설명합니다. Baermann 깔때기 방법, 고전적인 신생아 기술, 선택적으로 그들의 기판에서 활성 선충을 분리. 그것은 견본에서 거의 모든 활성 벌레를 복구하기 때문에, Baermann 깔때기 기술은 풍부하고 빠르게 성장하는 유전자형과 함께 생기는 희소하고 느린 성장 유전형의 복구를 허용합니다, 이는 재생의 다세대를 포함하는 추출 방법에서 놓칠 수 있습니다. 이 기술은 또한 대사 유전학, 인구 유전학 및 생태학적 질문을 해결하는 데 적합합니다. 그것은 동시에 샘플에서 전체 인구를 캡처, 나이의 자연 분포의 편견보기를 허용, 남녀, 그리고 유전자형. 이 프로토콜은 현장에서 대규모로 배포할 수 있게 해주며, 기판을 웜 플레이트로 빠르게 변환할 수 있으며 저자는 여러 대륙의 현장 작업을 통해 이를 검증했습니다.
실험실에서 C. elegans를 연구하는 연구원이 야생에서 C. elegans 및 관련 rhabditid 선충에 초점을 확장함에 따라 귀중한 생물학적 통찰력이 부상하고 있습니다. 야생 선충의 연구는 그들의 자연적인 맥락에서 유전자와 게놈을 배치, 잠재적으로 실험실 조건에 의해 가려진 기능을 공개1,2,3,4,5. 이 연구 결과는 진화 그 자체를 위한 전제 조건으로 통찰력을 생성합니다, 유전 변이6,7,8,9,10. 야생 샘플에 의해 포착된 자연적인 유전 변이는 또한 많은 복잡한 특성의 유전 기초로 진입을 제공합니다11,12,13.
선충의 자연 인구의 격리를 필요로 하는 연구를 설계할 때, 특히 원격 현장 작업을 수행할 때, 실용적인 고려 사항은 앞에 옵니다. 이 프로토콜은 미끼 또는 야생 기판에서 OP50에서 배양 될 수있는 활성 선충의 전체 인구를 깨끗하게 격리하는 것을 목표로합니다. 이 방법은 카노르하비티스, 오샤이우스 및 프리스티션슈를 포함한 자유 생활 rhabditid 및 디플로아스테로이드 선충을 추출하는 데 적합합니다.
그들의 기판에서 선충을 격리하기위한 많은 기술이있다14,15. 가장 기본적인 방법은 선충-중간 접시에 직접 기판을 배치하여 8,15마리를 기어나갈 때 동물을 따는 것입니다. 이 방법은 모든 선충을 샘플에서 분리하는 것이 목표인 경우 많은 시간과 노동이 필요합니다. 보다 정교한 기술은 동물의 무게, 크기, 이동성 또는 이들의 일부 조합을 활용14. 각 방법은 설정 및 처리량 측면에서 장점과 단점을 가지고 있습니다. 그(것)들은 또한 그들의 샘플링 바이어스에서 다르고 견본에 있는 동물이 방법의 분리 원리의 축에 따라 변화하는 경우에 특정 선충을 위해 선택할 수 있습니다.
Baermann 깔때기 방법은 기생 후크웜16을 포함하여 토양 주거 선충을 연구하는 동안 자바에 장치를 발명 네덜란드 의사 G. K. T. F. Baermann에 의해 1917 년에 처음 설명되었다. Baermann 깔때기는 이동성의 원리에 따라 작동합니다. 기판은 천 또는 종이 필터가 늘어선 깔때기에 배치됩니다 (“Kimwipe”는 현재 프로토콜에서 “보풀이없는 닦아”라고 불리는이 연구에 사용됩니다) 바닥에 닫혀 있습니다. 그런 다음 깔때기가 물로 채워져 필터가 밀봉 된 콘센트에서 분리하는 동안 샘플을 잠급합니다. 시료의 활성 선충은 물 속으로 자신을 방출하고 필터를 통해 수영, 결국 깔때기의 바닥에 정착. 깔때기 콘센트가 열리고 선충 한 방울을 접시에 내포합니다(그림 1).
그림 1: Baermann 깔때기 기술의 요약. (A) 관심있는 사이트에서 박테리아가 풍부한 샘플을 수집합니다. (B) Baermann 깔때기에 샘플을 잠급니다 웜이 몸부림치고 가라앉을 때까지 기다린다. (C) 깔때기에서 한 방울을 해제합니다. (D) 단일 헤르마프로디트 또는 짝짓기 암컷을 이동하여 판을 분리합니다. 삽화: 라민 라니 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Baermann 깔때기는 모든 종류의 선충 (특정 대안에 대한 토론 섹션 참조)에 대해 작동하지 않으며 Caenorhabditis 또는 작은 14의 크기 범위에서 활성 형태인 사람들에게 가장 적합합니다. 그러나, 연구가 Baermann 깔때기를 사용할 수 있는 경우, 많은 장점이 있다. 이 방법은 제한된 설정, 실습 시간 및 비용이 필요한 현장에서 실용적입니다. 연구원은 접시에 기판의 방해없이 깨끗한 샘플로 남아, 이는 쉽게 따기 수 있습니다. 필터를 사용하면 곤충 유충이나 미테에 의한 플레이트의 오염을 방지하며, 이는 샘플을 선충에 대고 접시를 피우거나 먹이를 먹는다. 가장 중요한 것은 Baermann 깔때기는 기판14에서 거의 모든 인구를 효율적으로 추출하며, 이는 연구의 설계에 따라 필요할 수 있습니다. 예를 들면, 야생 인구의 단계 또는 성 분포를 계산하거나, 느리게 성장하거나 희귀 한 유전자형을 찾거나, OP50에 끌리지 않는 선충을 샘플링하는 데 관심이있는 연구원은이 방법의 혜택을 누릴 수 있습니다. 이것은 샘플링 계획이 샘플링 시간에 인구의 스냅샷을 취하기 때문에 생태학17, 인구 유전학18, 또는 metagenetic19 질문을 공부하는 연구원을 위해 적습니다.
본 원고는 Baermann 깔때기를 사용하여 선충의 인구를 격리하고 현장에서 동소 여성과 동위 원소 라인을 확립하기 위한 완벽한 프로토콜을 설명하며, 간편한 운송을 위해 선택한 장비를 사용합니다. 연구실 근처에서 현장 작업을 수행하는 연구원의 경우 이러한 단계중 상당수가 생략되거나 단순화될 수 있습니다.
이 방법의 핵심 원리는 선충이 물에 잠긴 조직을 통과하고 기판과 더 큰 무척추 동물 오염 물질은 통과하지 못한다는 것입니다. 프로토콜의 중요한 단계는 (1) 적절한 기판을 수집하고, (2) 기판을 기체, 여과 물질로 감싸고, 물에서, (3) 필터를 통과하여 물 바닥으로 침몰한 벌레를 수집하고, (4) 개별 웜을 분리하여 동종 여성 또는 이소헤르마페로드라인을 생성한다. 이 방법의 다른 모든 부분은 사용 가능한 리소스, 기판의 특성 또는 현장 작업 목표에 따라 필요에 따라 수정할 수 있습니다. 고려 가치가 있는 일부 수정 사항은 다음과 같습니다.
열매를 심어 벌레를 미끼
현장 현장에서 발견되는 박테리아가 풍부한 썩는 재료의 충분한 공급이 없는 경우, 사과나 토마토 조각과 같은 샘플을 가져와 부패하게 할 수 있습니다. 미끼를 몇 가지 말뚝으로 잘 고정하여 큰 동물이 제거하지 않으므로 나중에 쉽게 수집 할 수 있습니다. 미끼가 부패하기 전에 건조 할 수있는 직사광선을 피하십시오.
사용 가능한 재료중 유입경로 장치 구축
튜브 클램프를 수용할 수 있을 만큼 크고 최고 무거운 깔때기를 지탱할 수 있을 만큼 안정적으로 구멍이 있는 모든 구조가 작동합니다. 단일 깔때기의 경우, 마시는 유리는 적합한 홀더입니다. 안면 조직, 화장지 또는 종이 타월과 같은 모든 종류의 조직을 사용할 수 있습니다.
저산소증 또는 감염을 방지하기 위해 깔때기에 물질을 적게 넣거나 대기 시간을 조정합니다.
시료가 벌레 또는 박테리아의 매우 높은 농도를 가지고 있는 경우에, 선충은 12 h 잠복기가 완료되기 전에 저산소증 또는 감염에서 정지하기 시작할 수 있습니다. 이것이 우려되는 경우, 연구원은 유입경로를 더 일찍 확인하거나 인구밀도가 높은 기판의 아주 작은 하위 샘플로 추가 깔때기를 준비할 수 있습니다.
NGM 플레이트 준비 조정을 실험적 요구 및 제약 조건에 맞게 조정
NGM 플레이트는 실험에 적합한 미디어 및 식품 공급원으로 제조할 수 있습니다. 위에서 설명한 필드 프로토콜은 수하물 중량을 최소화하도록 설계되었습니다. 수하물 제한 및 현장 작업 타이밍에 따라 실험실에서 준비되거나 상업적으로 구매한 이미 쏟아진 NGM 플레이트를 가져오는 것이 현장에 접시를 붓는 것보다 바람직할 수 있습니다.
실험실에서 깔때기 격리 수행
프로토콜은 자연에서 발생하는 선충 인구를 캡처하기 위해 필드 조건하에서 완전한 절차를 수행하는 것을 설명합니다. 일부 연구 목표에 대 한, 그것은 나중에 선충을 격리 하는 충분 한 수 있습니다., 밀봉 된 가방에 샘플실험실로 다시 여행 후. 그럼에도 불구하고 Baermann 깔때기 방법은 다른 격리 방법보다 살아남은 선충의 더 깨끗하고 완전한 샘플을 제공합니다. 그러나 밀봉 된 가방에 있는 샘플은 온도와 저산소증의 잠재적 인 극단에 노출되기 때문에 여행 중에 선택을 경험할 수 있습니다. 이는 샘플 수집 후 가능한 한 빨리 격리를 수행하여 최소화할 수 있습니다.
Baermann 깔때기에 대한 일반적인 대체 방법은 기판을 NGM 플레이트에 직접 배치하고 벌레가 기어 나올 때까지 기다리는 것을 포함하며, 이는 노동 집약적이거나 인구의 불완전한 수집을 초래합니다. 또한 미테와 곤충 애벌레로 오염된 접시를 산출합니다. Baermann 깔때기 방법은 활성 웜의 전체 인구를 기판에서 신속하게 분리하기위한 저비용 저기술 저노동 전략입니다.
Baermann 깔때기 방법은 모든 유형의 야생 선충을 수집하는 데 보편적으로 적용되지 않습니다. 일부 식물 주선선충은 기판에서 출현하는 데 12 시간보다 훨씬 오래 걸리며 너무 일찍 방출 된 물방울에서 결석할 것이며 일부 곤충 기생충은 바닥이 아닌 깔때기의 상단으로 기어 다니면서 collection14를 회피합니다. Baermann 깔때기에 대한 대안은 벌레를 복구하기 위해 더 전문적인 장비 또는 더 많은 노동력이 필요합니다. 그러나 위의 주의 사항이 실험에 문제가 되는 경우 여전히 선호될 수 있다. 반 Bezooijen14에 의해 검토 된 대체 옵션은 깔때기에 일정한 물 미트를 제공하는 깔때기 스프레이 방법을 포함, 산소를 추가하고 현탁액에 박테리아의 오버 플로우를 허용. 이것은 식물에서 선충의 더 확장 된 추출 기간을 허용합니다. 블렌더 원심 부양 방법은 특정 중력에 의해 분리하여 느리게 이동, 비활성 또는 상향 크롤링 선충을 복구하며, Oostenbrink 용출기는 중단된 선충으로부터 침전 침전물을 분리하기 위해 저류를 적용하고, Cobb의 방법은 신마토를 분리하기 위해 일련의 체, 크기, siation을 사용한다. 하지만 rhabditids를 수집하기 위해 Baermann 깔때기는 최소한의 노력으로 깨끗한 샘플을 신속하고 효과적으로 생성합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 NIH 보조금 R35GM141906 및 R21ES031364 및 데이먼 러니언 펠로우십 DRG-2371-19에 의해 지원되었다.
1 L glass bottle | NA | NA | Step 1 – vessel for making plate media |
1 mL pipette tips | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
1 mL pipetter | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
35 mm worm plates | Tritech | T3500 | Step 1 – worm plates |
4mm ID rubber tubing | Fisher | 14178A | Step 3 – part of the funnel |
60 mm worm plates | Greiner | 628161 | Step 1 – worm plates |
65 mm Funnel | Fisher | 22170156 | Step 3 – part of the funnel |
Calcium chloride | Fisher | C79-500 | Step 1 – worm plate medium |
Cooking pot | NA | NA | Step 1 – a water bath for melting the agar to pour plates |
E. coli strain OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Step 1 – worm food |
Field microscope | OMAX | G223CS | Step 6 – for viewing worms in the field |
Fly vial storage tray | Azer Scientific | ES-260T | Step 3 – to build a platform to hold 12 funnels |
Hot plate or stove | NA | NA | Step 1 – to heat the water bath |
Kimwipes | KimberlyClark | 34120 | Step 4 – filter for the funnels |
LB media | Gibco | 10855021 | Step 1 – for growing OP50 |
Lighter | NA | NA | Step 6 – sterilize the worm pick |
Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Step 1 – worm plate medium |
NGM-lite agar | USBiological | N1000 | Step 1 – worm plate medium |
Parafilm M wrapping film | Fisher | 13-374-10 | Step 6 – pack worm plates for travel |
Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-500 | Step 1 – worm plate medium |
Potassium phosphate monobasic | Fisher | P285-3 | Step 1 – worm plate medium |
scalpel | NA | NA | Step 3 – cut holes for the funnels |
scissors | NA | NA | Step 3 – cut the rubber tubing |
Tape | NA | NA | Step 3 – tape the funnel holder together |
Tubing clamps | Fisher | 5869 | Step 3 – part of the funnel |
Worm pick | NA | NA | Step 6 – for isolating individual worms |
Ziplock-style storage bags | NA | NA | Step 2 – to bag a substrate sample |