בידוד מהיר של נמטודות פראיות על ידי משפך ברמן
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה לחילוץ יעיל של נמטודות חיות ממצעים טבעיים בשטח.
Abstract
מעבר להיותם אורגניזמים חזקים מודל ניסיוני, אלגנים Caenorhabditis וקרובי משפחה שלה הם גם בעלי חיים אמיתיים שחיים בטבע. מחקרים על נמטודות בר בסביבתם הטבעית הם בעלי ערך להבנת היבטים רבים של הביולוגיה, כולל המשטרים הסלקטיביים שבהם מתפתחות דמויות גנומיות ופנוטיפיות ייחודיות, הבסיס הגנטי לשינוי תכונות מורכבות, והמגוון הגנטי הטבעי הבסיסי לכל אוכלוסיות בעלי החיים. כתב יד זה מתאר שיטה פשוטה ויעילה לחילוץ נמטודות מהמצעים הטבעיים שלהן, לרבות פירות נרקבים, פרחים, פטריות, חול עלים ואדמה. שיטת משפך ברמן, טכניקה נמטולוגית קלאסית, מבודדת באופן סלקטיבי נמטודות פעילות מהמצעים שלהן. מכיוון שהוא משחזר כמעט את כל התולעים הפעילות מהדגימה, טכניקת משפך ברמן מאפשרת התאוששות של גנוטיפים נדירים וצומחים לאט המתרחשים בשיתוף עם גנוטיפים שופעים הגדלים במהירות, אשר עלולים להחמיץ בשיטות מיצוי המערבות דורות רבים של רבייה. הטכניקה מתאימה גם לטיפול בשאלות מטגנטיות, אוכלוסיות-גנטיות ואקולוגיות. הוא לוכד את כל האוכלוסייה במדגם בו זמנית, ומאפשר מבט משוחד על ההתפלגות הטבעית של גילאים, מינים וגנוטיפים. הפרוטוקול מאפשר פריסה בקנה מידה גדול בשדה, המרה מהירה של מצעים ללוחות תולעים, והמחברים אימתו אותו באמצעות עבודת שטח ביבשות מרובות.
Introduction
תובנות ביולוגיות יקרות ערך מתגלות כאשר חוקרים החוקרים את C. elegans במעבדה מרחיבים את המיקוד שלהם ל– C. elegans ולנמטודות rhabditid הקשורות בטבע. מחקרים על נמטודות בר מציבים גנים וגנומים בהקשר הטבעי שלהם, וחושפים פונקציות שעלולות להיות מוסתרות על ידי תנאי מעבדה1,2,3,4,5. מחקרים אלה מייצרים תובנות לגבי תנאי הסף לאבולוציה עצמה, וריאציה גנטית 6,7,8,9,10. השונות הגנטית הטבעית שנלכדה על ידי דגימות בר מספקת גם חדירה לבסיס הגנטי של תכונות מורכבות רבות11,12,13.
בעת תכנון מחקרים הדורשים בידוד של אוכלוסיות טבעיות של נמטודות, במיוחד בעת ביצוע עבודת שטח מרחוק, שיקולים מעשיים באים לידי ביטוי. פרוטוקול זה נועד לבודד באופן נקי אוכלוסיות שלמות של נמטודות פעילות שניתן לתרבות על OP50 מפיתיון או מצעים פראיים. השיטה מתאימה היטב לחילוץ נמטודות rhabditid ו diplogasterid חיים חופשיים, כולל Caenorhabditis, Oscheius, ו Pristionchus.
ישנן טכניקות רבות לבידוד נמטודות מהמצעים שלהן14,15. הגישה הבסיסית ביותר היא למקם את המצע ישירות על צלחת נמטודה בינונית, לקטוף בעלי חיים כפי שהם זוחלים החוצה8,15. שיטה זו דורשת כמויות גדולות של זמן ועבודה אם המטרה היא לבודד את כל הנמטודות מדגם. טכניקות מתוחכמות יותר מנצלות את המשקל, הגודל, הניידות של בעלי החיים או שילוב כלשהו של אלה14. לכל שיטה יש את היתרונות והחסרונות שלה מבחינת ההתקנה והתפוקה. הם גם שונים בהטיות הדגימה שלהם ועשויים לבחור עבור נמטודות מסוימות אם בעלי החיים במדגם משתנים לאורך ציר עקרון ההפרדה של השיטה.
שיטת משפך ברמן תוארה לראשונה בשנת 1917 על ידי הרופא ההולנדי G. K. K. T. F. Baermann, שהמציא את המכשיר בג’אווה תוך כדי לימוד נמטודות שוכנות בקרקע, כולל תולעת הקרס הטפילית16. משפך ברמן פועל על בסיס עקרון הניידות. המצע ממוקם במשפך מרופד במסנן בד או נייר (“Kimwipe” משמש למחקר זה, המכונה “ניגוב ללא מוך” בפרוטוקול הנוכחי) וסגור אטום בתחתית. לאחר מכן המשפך מלא במים, שקוע המדגם בעוד המסנן מפריד אותו מן השקע האטום. נמטודות פעילות במדגם משחררות את עצמן למים ושוחות דרך המסנן, ובסופו של דבר מתיישבות בתחתית המשפך. שקע המשפך נפתח, וטיפת נמטודות מסולקת לצלחת (איור 1).
איור 1: סיכום טכניקת משפך ברמן. (א) איסוף דגימה עשירה בחיידקים מאתר מעניין. (ב) טבילת הדגימה במשפך של ברמן והמתנה לתולעים שיתפתלו החוצה ויטבעו. (ג) שחרור טיפה אחת מהמשפך. (ד) העברת הרמפרודיטים בודדים או נקבות מזווגות ללוחות נפרדים. איור שיצר ראמין רחמני. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
משפך ברמן לא יעבוד עבור כל סוג של נמטודה (ראה סעיף דיון עבור חלופות ספציפיות) והוא מתאים ביותר לאלה שהם צורות פעילות בטווח הגודל של Caenorhabditis או קטן יותר14. עם זאת, אם מחקר יכול להשתמש משפך Baermann, ישנם יתרונות רבים. השיטה מעשית בתחום, הדורשת התקנה מוגבלת, זמן מעשי ועלות. החוקר נשאר עם מדגם נקי ללא חסימה של המצע על הצלחת, מה שהופך את הבחירה קלה. שימוש במסנן גם מונע זיהום של הצלחת על ידי זחלי חרקים או קרדיות, אשר לועסים צלחות או טרף על נמטודות במדגם. והכי חשוב, משפך Baermann ביעילות מחלץ כמעט את כל האוכלוסייה מן המצע14, אשר עשוי להידרש בהתאם לעיצוב המחקר. לדוגמה, חוקרים המעוניינים לספור את השלב או ההפצה המינית של אוכלוסיות הבר, למצוא גנוטיפים הגדלים לאט או נדירים, או לדגום נמטודות שאינן נמשכות ל- OP50 עשויים להפיק תועלת משיטה זו. זה מתאים לחוקרים החוקרים ecological17, אוכלוסייה גנטית18, או metagenetic19 שאלות כמו ערכת הדגימה לוקח תמונה של האוכלוסייה בזמן הדגימה.
כתב היד הנוכחי מתאר פרוטוקול שלם לבידוד אוכלוסיות נמטודות באמצעות משפך ברמן והקמת קווי איזופל ואיזוהרמפרודיטה בשטח, תוך שימוש בציוד שנבחר להובלה קלה. עבור חוקרים המבצעים עבודת שטח ליד המעבדות שלהם, רבים מהשלבים האלה יכולים להיות מושמטים או פשוטים יותר.
Protocol
Representative Results
Discussion
העיקרון המרכזי של שיטה זו הוא כי נמטודות יעברו דרך הרקמה שקועה במים, בעוד המצע שלהם ומזהמים חסרי חוליות גדולים יותר לא. השלבים הקריטיים של הפרוטוקול הם (1) איסוף מצע מתאים, (2) טבילת המצע, עטוף בחומר סינון, במים, (3) איסוף תולעים שעברו דרך המסנן ושקעו לתחתית המים, ו -(4) בידוד תולעים בודדות כדי ליצור קווי איזופל או איזוהרמפרודיט. כל החלקים האחרים של השיטה ניתנים לשינוי לפי הצורך בהתאם למשאבים הזמינים, אופי המצעים או מטרות עבודת השטח. כמה שינויים שכדאי לשקול הם כדלקמן.
פיתיון התולעים על ידי שתילת פירות
אם אין אספקה בשפע של חומר רקוב עשיר בחיידקים שניתן למצוא באתר השדה, אפשר לרצות להביא דגימה, כגון חתיכת תפוח או עגבניה, להשאיר להירקב. הצמד את הפיתיון למטה היטב עם כמה יתדות, כך בעלי חיים גדולים יותר לא להסיר אותם ולכן ניתן למצוא אותו בקלות מאוחר יותר לאיסוף. הימנע מאור שמש ישיר, שבו הפיתיון עלול להתייבש לפני שהוא נרקב.
בניית מנגנון משפך מתוך כל החומרים הזמינים
כל מבנה עם חורים גדולים מספיק כדי להכיל את מהדק הצינורות ויציב מספיק כדי לתמוך במשפך כבד ביותר יעבוד. עבור משפך יחיד, שתייה היא מחזיק מתאים. ניתן להשתמש בכל סוג של רקמה – רקמת פנים, נייר טואלט או מגבות נייר.
לשים פחות חומר במשפכים, או להתאים את זמן ההמתנה, כדי למנוע היפוקסיה או זיהום
אם המדגם יש ריכוז גבוה מאוד של תולעים או חיידקים, נמטודות עשוי להתחיל למות היפוקסיה או זיהום לפני הדגירה 12 שעות הושלמה. אם זה מדאיג, החוקר עשוי לבדוק משפכים מוקדם יותר או להכין משפך נוסף עם תת-דגימה קטנה מאוד של המצע המאוכלס מאוד.
התאמת הכנת צלחת NGM לצרכים ואילוצים ניסיוניים
ניתן להכין צלחות NGM עם כל מדיה ומקור מזון המתאים לניסוי. פרוטוקול השדה המתואר לעיל נועד למזער את משקל המטען. בהתאם למגבלות המטען ולתזמון עבודת השטח, הבאת לוחות NGM שכבר נשפכו – או שהוכנו במעבדה או נרכשו מסחרית – עשויים להיות עדיפים ולא לשפוך צלחות בשטח.
ביצוע בידודי המשפך במעבדה
הפרוטוקול מתאר את ביצוע ההליך המלא בתנאי שדה כדי ללכוד את אוכלוסיית הנמטודות כפי שהיא מתרחשת בטבע. עבור כמה מטרות מחקר, זה עשוי להיות מספיק כדי לבודד נמטודות מאוחר יותר, לאחר נסיעה חזרה למעבדה עם דגימות בשקיות אטומות. גם אז, שיטת משפך ברמן מספקת מדגם נקי ומלא יותר של הנמטודות ששרדו מאשר שיטות בידוד אחרות. עם זאת, דגימות בשקיות אטומות עשויות לחוות בחירה במהלך הנסיעה, כפי שהם חשופים לקיצוניות פוטנציאלית של טמפרטורה והיפוקסיה. ניתן למזער זאת על ידי ביצוע בידודים בהקדם האפשרי לאחר איסוף מדגם.
שיטה חלופית נפוצה למשפך ברמן כוללת הצבת המצע ישירות על צלחת NGM והמתנה לתולעים לזחול החוצה, שהיא או עתירת עבודה או גורמת לאיסוף לא שלם של האוכלוסייה. הוא גם מניב צלחות מזוהמות בקרדית ובזחלי חרקים. שיטת משפך ברמן היא אסטרטגיה זולה, לואו-טק, עבודה נמוכה להפרדה מהירה של כל אוכלוסיית התולעים הפעילות מהמצע שלהן.
שיטת משפך ברמן אינה ישימה באופן אוניברסלי לאיסוף כל סוגי הנמטודות הפראיות. כמה נמטודות שוכנות צמחים לוקח הרבה יותר מ 12 שעות לצאת מן המצע שלהם ייעדר טיפה שוחרר מוקדם מדי, בעוד כמה טפילים חרקים יזחלו לחלק העליון של המשפך ולא התחתון, גם התחמקות אוסף14. חלופות למשפך ברמן דורשות ציוד מיוחד יותר או יותר עבודה כדי לשחזר את התולעים. עם זאת, הם עדיין עשויים להיות מועדפים אם האזהרות לעיל הן בעיה לניסוי. אפשרויות חלופיות, שנסקרו על ידי ואן Bezooijen14, כוללות את שיטת תרסיס המשפך, המספקת ערפל קבוע של מים למשפכים, מוסיפה חמצן ומאפשרת הצפה של חיידקים בהשעיה. זה מאפשר תקופת מיצוי ממושכת יותר של נמטודות מצמחים. שיטת הציפה הצנטריפוגלית של בלנדר משחזרת נמטודות הנעות באיטיות, לא פעילות או זוחלות כלפי מעלה על ידי הפרדתן על ידי כוח המשיכה הספציפי שלהן, מציין Oostenbrink מיישם זרם חסר כדי להפריד בין משקעים מתיישבים לנמטודות מושעות, והשיטה של קוב משתמשת בסדרה של מסננות כדי לבודד נמטודות לפי גודלן, צורתן ושיעור המשקעים שלהן14. עם זאת, כדי לאסוף rhabditids, משפך Baermann מייצר ביעילות דגימות נקיות במהירות ובמאמץ מינימלי.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R35GM141906 ו R21ES031364 ועמית דיימון רניון DRG-2371-19.
Materials
| 1 L glass bottle | NA | NA | Step 1 – vessel for making plate media |
| 1 mL pipette tips | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
| 1 mL pipetter | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
| 35 mm worm plates | Tritech | T3500 | Step 1 – worm plates |
| 4mm ID rubber tubing | Fisher | 14178A | Step 3 – part of the funnel |
| 60 mm worm plates | Greiner | 628161 | Step 1 – worm plates |
| 65 mm Funnel | Fisher | 22170156 | Step 3 – part of the funnel |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | Step 1 – worm plate medium |
| Cooking pot | NA | NA | Step 1 – a water bath for melting the agar to pour plates |
| E. coli strain OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Step 1 – worm food |
| Field microscope | OMAX | G223CS | Step 6 – for viewing worms in the field |
| Fly vial storage tray | Azer Scientific | ES-260T | Step 3 – to build a platform to hold 12 funnels |
| Hot plate or stove | NA | NA | Step 1 – to heat the water bath |
| Kimwipes | KimberlyClark | 34120 | Step 4 – filter for the funnels |
| LB media | Gibco | 10855021 | Step 1 – for growing OP50 |
| Lighter | NA | NA | Step 6 – sterilize the worm pick |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Step 1 – worm plate medium |
| NGM-lite agar | USBiological | N1000 | Step 1 – worm plate medium |
| Parafilm M wrapping film | Fisher | 13-374-10 | Step 6 – pack worm plates for travel |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-500 | Step 1 – worm plate medium |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | P285-3 | Step 1 – worm plate medium |
| scalpel | NA | NA | Step 3 – cut holes for the funnels |
| scissors | NA | NA | Step 3 – cut the rubber tubing |
| Tape | NA | NA | Step 3 – tape the funnel holder together |
| Tubing clamps | Fisher | 5869 | Step 3 – part of the funnel |
| Worm pick | NA | NA | Step 6 – for isolating individual worms |
| Ziplock-style storage bags | NA | NA | Step 2 – to bag a substrate sample |
References
- Frezal, L., Felix, M. A. C. elegans outside the Petri dish. Elife. 4, 05849 (2015).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Reddy, K. C., et al. Antagonistic paralogs control a switch between growth and pathogen resistance in C. elegans. PLOS Pathogens. 15 (1), 1007528 (2019).
- Schulenburg, H., Felix, M. A. The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Andersen, E. C., et al. Chromosome-scale selective sweeps shape Caenorhabditis elegans genomic diversity. Nature Genetics. 44 (3), 285-290 (2012).
- Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource. Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2017).
- Crombie, T. A., et al. Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations. Elife. 8, 50465 (2019).
- Lee, D., et al. Balancing selection maintains hyper-divergent haplotypes in Caenorhabditis elegans. Nature Ecology & Evolution. 5 (6), 794-807 (2021).
- Rockman, M. V., Kruglyak, L. Recombinational landscape and population genomics of Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 5 (3), 1000419 (2009).
- Evans, K. S., van Wijk, M. H., McGrath, P. T., Andersen, E. C., Sterken, M. G. From QTL to gene: C. elegans facilitates discoveries of the genetic mechanisms underlying natural variation. Trends in Genetics. 37, 933-947 (2021).
- Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genetics Research (Cambridge Core). 92 (5-6), 331-348 (2010).
- Noble, L. M., Rockman, M. V., Teotonio, H. Gene-level quantitative trait mapping in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 11 (2), 061 (2021).
- Van Bezooijen, J. . Methods and techniques for nematology. , (2006).
- Barrièrre, A., Félix, M. -. A. Isolation of C. elegans. and related nematodes. Wormbook. , (2014).
- Baermann, G. Eine einfache Methode zur Auffindung von Anklostomum (Nematoden) Larven in Erdproben. Geneeskundig tijdschrift voor Nederlandsch-Indië. 57, 131-137 (1917).
- Gray, N. F. Ecology of nematophagous fungi Panagrellus redivivus as the target organism. Plant and Soil. 297, 293-297 (1983).
- Mallez, S., Castagnone, C., Espada, M., Viera, P., Eisenback, J., Mota, M., Guillemaud, T., Castagnone-Sereno, P. First insights into the genetic diversity of the pinewood nematode in its native area using new polymorphic microsatellite loci. PLOS ONE. 8 (3), 4-11 (2013).
- Kerfahi, D., Tripathi, M. B., Porazinska, L. D., Park, J., Go, R., Adams, M. J. Do tropical rain forest soils have greater nematode diversity than High Arctic tundra? A metagenetic comparison of Malaysia and Svalbard. Global Ecology and Biogeography. 25, 716-728 (2016).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application. PLOS ONE. 16, 0254293 (2021).
- Lints, R., Hall, D. H. Handbook of C. elegans male anatomy. WormAtlas. , (2005).
- Kiontke, K., Félix, M. -. A., Ailion, M., Rockman, M. V., Braendle, C., Pénigault, J. -. B., Fitch, D. H. A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits. BMC Evolutionary Biology. 11, 339 (2011).
