Быстрая изоляция диких нематод воронкой Baermann
Summary
Этот протокол описывает метод эффективного извлечения живых нематод из природных субстратов в полевых условиях.
Abstract
Помимо того, что Caenorhabditis elegans и его родственники являются надежными экспериментальными модельными организмами, они также являются реальными животными, которые живут в природе. Исследования диких нематод в их естественной среде ценны для понимания многих аспектов биологии, включая селективные режимы, в которых развиваются отличительные геномные и фенотипические признаки, генетическую основу для изменения сложных признаков и естественное генетическое разнообразие, фундаментальное для всех популяций животных. Эта рукопись описывает простой и эффективный метод извлечения нематод из их естественных субстратов, включая гниющие фрукты, цветы, грибы, опавшие листья и почву. Метод воронки Баермана, классический метод нематологии, избирательно изолирует активных нематод от их субстратов. Поскольку он извлекает почти всех активных червей из образца, метод воронки Baermann позволяет восстанавливать редкие и медленно растущие генотипы, которые встречаются совместно с обильными и быстрорастущими генотипами, которые могут быть пропущены в методах экстракции, включающих несколько поколений размножения. Метод также хорошо подходит для решения метагенетических, популяционно-генетических и экологических вопросов. Он захватывает всю популяцию в выборке одновременно, позволяя непредвзято взглянуть на естественное распределение возрастов, полов и генотипов. Протокол позволяет развертывать в масштабе в полевых условиях, быстро превращая субстраты в червячные пластины, и авторы подтвердили его в ходе полевых работ на нескольких континентах.
Introduction
Ценные биологические идеи появляются по мере того, как исследователи, изучающие C. elegans в лаборатории, расширяют свое внимание на C. elegans и связанных с ними рабдитидных нематод в дикой природе. Исследования диких нематод помещают гены и геномы в их естественный контекст, выявляя функции, потенциально скрытые лабораторными условиями1,2,3,4,5. Эти исследования дают представление о предпосылках самой эволюции, генетической изменчивости6,7,8,9,10. Естественная генетическая изменчивость, захваченная дикими образцами, также обеспечивает проникновение в генетическую основу многих сложных признаков11,12,13.
При разработке исследований, требующих изоляции естественных популяций нематод, особенно при выполнении удаленных полевых работ, на первый план выходят практические соображения. Этот протокол направлен на то, чтобы четко изолировать целые популяции активных нематод, которые могут быть культивированы на OP50, от приманки или диких субстратов. Метод хорошо подходит для извлечения свободноживущих рабдитидных и диплогастеридных нематод, включая Caenorhabditis, Oscheius и Pristionchus.
Существует множество методов выделения нематод из их субстратов14,15. Самый основной подход заключается в том, чтобы поместить субстрат непосредственно на пластину нематодной среды, подбирая животных, когда они выползают8,15. Этот метод требует большого количества времени и труда, если цель состоит в том, чтобы изолировать всех нематод из образца. Более сложные методы используют вес, размер, подвижность животных или их комбинацию14. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки с точки зрения настройки и пропускной способности. Они также различаются по своим смещениям выборки и могут выбирать для определенных нематод, если животные в образце изменяются вдоль оси принципа разделения метода.
Метод воронки Баермана был впервые описан в 1917 году голландским врачом Г. К. Т. Ф. Бэрманом, который изобрел устройство на Яве при изучении обитающих в почве нематод, включая паразитического анкилостома16. Воронка Baermann функционирует на основе принципа мобильности. Подложку помещают в воронку, выстланную тканевым или бумажным фильтром (для этого исследования используется «Kimwipe», называемый «безворсовой салфеткой» в текущем протоколе) и запечатывают внизу. Затем воронка заполняется водой, погружая образец, в то время как фильтр отделяет его от герметичного выхода. Активные нематоды в образце выпускают себя в воду и плавают через фильтр, в конечном итоге оседая на дне воронки. Отверстие воронки открывается, и капля нематод выбрасывается на пластину (рисунок 1).
Рисунок 1: Краткое изложение метода воронки Баермана. (A) Сбор богатого бактериями образца с интересующего сайта. (B) Погружение образца в воронку Baermann и ожидание, пока черви вывернутся и утонут. (C) Выпуск одной капли из воронки. (D) Перемещение одиночных гермафродитов или спаренных самок в отдельные пластины. Иллюстрация создана Рамином Рахни. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Воронка Baermann не будет работать для каждого вида нематод (см. Раздел обсуждения для конкретных альтернатив) и лучше всего подходит для тех, которые являются активными формами в диапазоне размеров Caenorhabditis или меньше14. Однако, если в исследовании можно использовать воронку Баермана, есть много преимуществ. Метод практичен в полевых условиях, требуя ограниченной настройки, практического времени и стоимости. Исследователю остается чистый образец без обструкции подложки на пластине, что облегчает сбор. Использование фильтра также предотвращает загрязнение пластины личинками насекомых или клещами, которые пережевывают тарелки или охотятся на нематод в образце. Самое главное, что воронка Baermann эффективно извлекает почти всю популяцию из субстрата14, что может потребоваться в зависимости от дизайна исследования. Например, исследователи, заинтересованные в подсчете стадии диких популяций или распределении пола, поиске медленно растущих или редких генотипов или выборке нематод, не привлеченных к OP50, могут извлечь выгоду из этого метода. Это подходит для исследователей, изучающих экологические17, популяционные генетические18 или метагенетические вопросы19 , поскольку схема выборки делает снимок популяции во время выборки.
Настоящая рукопись описывает полный протокол для выделения популяций нематод с использованием воронки Баермана и установления изофемал и изогермафродитовых линий в полевых условиях с использованием оборудования, выбранного для легкой транспортировки. Для исследователей, проводящих полевые работы рядом со своими лабораториями, многие из этих шагов могут быть опущены или упрощены.
Protocol
Representative Results
Discussion
Центральный принцип этого метода заключается в том, что нематоды будут проходить через ткань, погруженную в воду, в то время как их субстрат и более крупные загрязнители беспозвоночных не будут. Критическими этапами протокола являются (1) сбор соответствующего субстрата, (2) погружение субстрата, обернутого в фильтрующий материал, в воду, (3) сбор червей, которые прошли через фильтр и опустились на дно воды, и (4) изоляция отдельных червей для создания изофемал или изогермафродитовых линий. Все остальные части метода поддаются модификации по мере необходимости в соответствии с имеющимися ресурсами, характером субстратов или целями полевых работ. Некоторые изменения, которые стоит рассмотреть, заключаются в следующем.
Травля червей путем посадки фруктов
Если на полевом участке нет достаточного запаса богатого бактериями гниющего материала, можно принести образец, такой как кусок яблока или помидора, чтобы оставить гнить. Хорошо прикрепите приманку несколькими кольями, чтобы более крупные животные не убрали их и чтобы ее можно было легко найти позже для сбора. Избегайте прямых солнечных лучей, где приманка может высохнуть до того, как сгниет.
Построение воронкообразных аппаратов из любых доступных материалов
Подойдет любая конструкция с отверстиями, достаточно большими для размещения зажима трубки и достаточно устойчивыми для поддержки верхней тяжелой воронки. Для одной воронки подходящим держателем является питьевой стакан. Можно использовать любой вид салфетки – салфетки для лица, туалетную бумагу или бумажные полотенца.
Помещение меньшего количества материала в воронки или корректировка времени ожидания для предотвращения гипоксии или инфекции
Если образец имеет очень высокую концентрацию червей или бактерий, нематоды могут начать умирать от гипоксии или инфекции до завершения 12-часовой инкубации. Если это вызывает беспокойство, исследователь может проверить воронки раньше или подготовить дополнительную воронку с очень небольшим подвыборкой густонаселенного субстрата.
Адаптация подготовки пластины NGM к экспериментальным потребностям и ограничениям
Пластины NGM могут быть приготовлены с любыми средами и источниками пищи, подходящими для эксперимента. Полевой протокол, описанный выше, предназначен для минимизации веса багажа. В зависимости от ограничений багажа и сроков полевых работ, приносить уже налитые пластины NGM – либо подготовленные в лаборатории, либо приобретенные на коммерческой основе – может быть предпочтительнее, чем разливать пластины в поле.
Выполнение изоляции воронки в лаборатории
Протокол описывает проведение полной процедуры в полевых условиях для захвата популяции нематод в том виде, в каком это происходит в природе. Для некоторых исследовательских целей может быть достаточно изолировать нематод позже, после возвращения в лабораторию с образцами в запечатанных пакетах. Даже в этом случае метод воронки Баермана обеспечивает более чистый и полный образец выживших нематод, чем другие методы изоляции. Однако образцы в герметичных пакетах могут подвергаться отбору во время путешествия, поскольку они подвергаются воздействию потенциальных экстремальных температур и гипоксии. Это можно свести к минимуму, выполнив изоляцию как можно скорее после сбора проб.
Общий альтернативный метод воронки Baermann включает в себя размещение субстрата непосредственно на пластине NGM и ожидание, пока черви выползут, что либо очень трудоемко, либо приводит к неполному сбору популяции. Он также дает пластины, загрязненные клещами и личинками насекомых. Метод воронки Баермана — это недорогая, низкотехнологичная, малотрудовая стратегия для быстрого отделения всей популяции активных червей от их субстрата.
Метод воронки Баермана не является универсально применимым для сбора всех видов диких нематод. Некоторым растительным нематодам требуется гораздо больше 12 ч, чтобы выйти из своего субстрата, и они будут отсутствовать в капле, выпущенной слишком рано, в то время как некоторые насекомые-паразиты будут ползать к вершине воронки, а не к низу, также уклоняясь от коллекции14. Альтернативы воронке Baermann требуют либо более специализированного оборудования, либо больше труда для восстановления червей. Тем не менее, они все еще могут быть предпочтительными, если приведенные выше предостережения являются проблемой для эксперимента. Альтернативные варианты, рассмотренные van Bezooijen14, включают метод воронкообразного распыления, который обеспечивает постоянный туман воды в воронках, добавляя кислород и позволяя переливать бактерии в суспензии. Это позволяет более длительный период экстракции нематод из растений. Метод центробежной флотации блендера восстанавливает медленно движущихся, неактивных или ползучих вверх нематод, разделяя их по удельному весу, элютриатор Остенбринка применяет подводное течение для отделения оседающего осадка от взвешенных нематод, а метод Кобба использует серию сит для выделения нематод по их размеру, форме и скорости осаждения14. Однако для сбора рабдитидов воронка Baermann эффективно производит чистые образцы быстро и с минимальными усилиями.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантами NIH R35GM141906 и R21ES031364 и Damon Runyon Fellowship DRG-2371-19.
Materials
| 1 L glass bottle | NA | NA | Step 1 – vessel for making plate media |
| 1 mL pipette tips | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
| 1 mL pipetter | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
| 35 mm worm plates | Tritech | T3500 | Step 1 – worm plates |
| 4mm ID rubber tubing | Fisher | 14178A | Step 3 – part of the funnel |
| 60 mm worm plates | Greiner | 628161 | Step 1 – worm plates |
| 65 mm Funnel | Fisher | 22170156 | Step 3 – part of the funnel |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | Step 1 – worm plate medium |
| Cooking pot | NA | NA | Step 1 – a water bath for melting the agar to pour plates |
| E. coli strain OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Step 1 – worm food |
| Field microscope | OMAX | G223CS | Step 6 – for viewing worms in the field |
| Fly vial storage tray | Azer Scientific | ES-260T | Step 3 – to build a platform to hold 12 funnels |
| Hot plate or stove | NA | NA | Step 1 – to heat the water bath |
| Kimwipes | KimberlyClark | 34120 | Step 4 – filter for the funnels |
| LB media | Gibco | 10855021 | Step 1 – for growing OP50 |
| Lighter | NA | NA | Step 6 – sterilize the worm pick |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Step 1 – worm plate medium |
| NGM-lite agar | USBiological | N1000 | Step 1 – worm plate medium |
| Parafilm M wrapping film | Fisher | 13-374-10 | Step 6 – pack worm plates for travel |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-500 | Step 1 – worm plate medium |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | P285-3 | Step 1 – worm plate medium |
| scalpel | NA | NA | Step 3 – cut holes for the funnels |
| scissors | NA | NA | Step 3 – cut the rubber tubing |
| Tape | NA | NA | Step 3 – tape the funnel holder together |
| Tubing clamps | Fisher | 5869 | Step 3 – part of the funnel |
| Worm pick | NA | NA | Step 6 – for isolating individual worms |
| Ziplock-style storage bags | NA | NA | Step 2 – to bag a substrate sample |
References
- Frezal, L., Felix, M. A. C. elegans outside the Petri dish. Elife. 4, 05849 (2015).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Reddy, K. C., et al. Antagonistic paralogs control a switch between growth and pathogen resistance in C. elegans. PLOS Pathogens. 15 (1), 1007528 (2019).
- Schulenburg, H., Felix, M. A. The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Andersen, E. C., et al. Chromosome-scale selective sweeps shape Caenorhabditis elegans genomic diversity. Nature Genetics. 44 (3), 285-290 (2012).
- Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource. Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2017).
- Crombie, T. A., et al. Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations. Elife. 8, 50465 (2019).
- Lee, D., et al. Balancing selection maintains hyper-divergent haplotypes in Caenorhabditis elegans. Nature Ecology & Evolution. 5 (6), 794-807 (2021).
- Rockman, M. V., Kruglyak, L. Recombinational landscape and population genomics of Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 5 (3), 1000419 (2009).
- Evans, K. S., van Wijk, M. H., McGrath, P. T., Andersen, E. C., Sterken, M. G. From QTL to gene: C. elegans facilitates discoveries of the genetic mechanisms underlying natural variation. Trends in Genetics. 37, 933-947 (2021).
- Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genetics Research (Cambridge Core). 92 (5-6), 331-348 (2010).
- Noble, L. M., Rockman, M. V., Teotonio, H. Gene-level quantitative trait mapping in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 11 (2), 061 (2021).
- Van Bezooijen, J. . Methods and techniques for nematology. , (2006).
- Barrièrre, A., Félix, M. -. A. Isolation of C. elegans. and related nematodes. Wormbook. , (2014).
- Baermann, G. Eine einfache Methode zur Auffindung von Anklostomum (Nematoden) Larven in Erdproben. Geneeskundig tijdschrift voor Nederlandsch-Indië. 57, 131-137 (1917).
- Gray, N. F. Ecology of nematophagous fungi Panagrellus redivivus as the target organism. Plant and Soil. 297, 293-297 (1983).
- Mallez, S., Castagnone, C., Espada, M., Viera, P., Eisenback, J., Mota, M., Guillemaud, T., Castagnone-Sereno, P. First insights into the genetic diversity of the pinewood nematode in its native area using new polymorphic microsatellite loci. PLOS ONE. 8 (3), 4-11 (2013).
- Kerfahi, D., Tripathi, M. B., Porazinska, L. D., Park, J., Go, R., Adams, M. J. Do tropical rain forest soils have greater nematode diversity than High Arctic tundra? A metagenetic comparison of Malaysia and Svalbard. Global Ecology and Biogeography. 25, 716-728 (2016).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application. PLOS ONE. 16, 0254293 (2021).
- Lints, R., Hall, D. H. Handbook of C. elegans male anatomy. WormAtlas. , (2005).
- Kiontke, K., Félix, M. -. A., Ailion, M., Rockman, M. V., Braendle, C., Pénigault, J. -. B., Fitch, D. H. A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits. BMC Evolutionary Biology. 11, 339 (2011).
