Baermann Huni tarafından Vahşi Nematodların Hızlı İzolasyonu
Summary
Bu protokol, alandaki doğal substratlardan canlı nematodları verimli bir şekilde çıkarmak için bir yöntem özetler.
Abstract
Caenorhabditis elegans ve yakınları, sağlam deneysel model organizmalar olmanın ötesinde, doğada yaşayan gerçek hayvanlardır. Vahşi nematodların doğal ortamlarında yapılan çalışmalar, ayırt edici genomik ve fenotipik karakterlerin evrimleştiği seçici rejimler, karmaşık özellik varyasyonunun genetik temeli ve tüm hayvan popülasyonları için temel olan doğal genetik çeşitlilik de dahil olmak üzere biyolojinin birçok yönünü anlamak için değerlidir. Bu makale, çürüyen meyveler, çiçekler, mantarlar, yaprak çöpü ve toprak dahil olmak üzere nematodları doğal substratlarından çıkarmak için basit ve verimli bir yöntemi açıklar. Klasik bir nematoloji tekniği olan Baermann huni yöntemi, aktif nematodları seçici olarak alt tabakalarından izole eder. Örnekten neredeyse tüm aktif solucanları kurtardığı için, Baermann huni tekniği, birden fazla üreme neslini içeren ekstraksiyon yöntemlerinde kaçırılabilecek bol ve hızlı büyüyen genotiplerle birlikte ortaya çıkan nadir ve yavaş büyüyen genotiplerin geri kazanılmasına izin verir. Teknik ayrıca metagenetik, popülasyon-genetik ve ekolojik soruları ele almak için de uygundur. Tüm popülasyonu aynı anda bir örnekte yakalar ve yaşların, cinsiyetlerin ve genotiplerin doğal dağılımının tarafsız bir görünümünü sağlar. Protokol, alanda uygun ölçekte dağıtıma izin verir, substratları hızla solucan plakalarına dönüştürür ve yazarlar bunu birden fazla kıtada saha çalışmasıyla doğrular.
Introduction
Laboratuvarda C. eleganları inceleyen araştırmacılar odaklarını vahşi doğada C. eleganlara ve ilgili rabditid nematodlara genişlettikçe değerli biyolojik içgörüler ortaya çıkıyor. Yabani nematodlar çalışmaları genleri ve genomları doğal bağlamlarına yerleştirir ve laboratuvar koşulları tarafından potansiyel olarak gizlenen işlevleri ortaya çıkarır1,2,3,4,5. Bu çalışmalar, evrimin kendisi için ön koşul olan genetik varyasyon6,7,8,9,10 hakkında içgörüler üretmektedir. Vahşi örnekler tarafından yakalanan doğal genetik varyasyon, birçok karmaşık özelliğin genetik temeline de yol açmaktadır11,12,13.
Nematodların doğal popülasyonlarının izolasyonu gerektiren çalışmalar tasarlarken, özellikle uzaktan saha çalışması yaparken pratik hususlar ön plana çıkar. Bu protokol, OP50’de kültürlenebilen aktif nematod popülasyonlarının tamamını yem veya vahşi substratlardan temiz bir şekilde izole etmeyi amaçlamaktadır. Yöntem, Caenorhabditis, Oscheius ve Pristionchus dahil olmak üzere serbest yaşayan rabditid ve diplogasterid nematodları çıkarmak için çok uygundur.
Nematodları alt tabakalarından izole etmek için birçok teknik vardır14,15. En temel yaklaşım, alt tabakayı doğrudan nematod-orta plakaya yerleştirmek ve hayvanları 8,15’e kadar sürünerek seçmektir. Amaç bir numuneden tüm nematodları izole etmekse, bu yöntem büyük miktarda zaman ve emek gerektirir. Daha karmaşık teknikler, hayvanların ağırlığından, boyutundan, hareketliliğinden veya bunların bir kombinasyonundan yararlanır14. Her yöntemin kurulum ve aktarım hızı açısından avantajları ve dezavantajları vardır. Ayrıca örnekleme önyargılarında farklılık gösterirler ve numunedeki hayvanlar yöntemin ayırma prensibinin ekseni boyunca değişirse belirli nematodları seçebilirler.
Baermann huni yöntemi ilk olarak 1917’de, parazitik kanca kurdu16 da dahil olmak üzere toprakta yaşayan nematodları incelerken cihazı Java’da icat eden Hollandalı Doktor G. K. T. F. Baermann tarafından tanımlanmıştır. Baermann hunisi hareketlilik prensibine göre çalışır. Substrat, bir bez veya kağıt filtre ile kaplı bir huni içine yerleştirilir (bu çalışma için mevcut protokolde “tüy bırakmayan silme” olarak adlandırılan bir “Kimwipe” kullanılır) ve altta kapatılır. Huni daha sonra su ile doldurulur ve filtre kapalı prizden ayırırken numuneyi batırır. Numunedeki aktif nematodlar kendilerini suya bırakır ve filtreden yüzerek huni tabanına yerleşir. Huni çıkışı açılır ve bir damla nematod bir tabağa atılır (Şekil 1).
Şekil 1: Baermann huni tekniğinin özeti. (A) İlgi çekici bir siteden bakteri bakımından zengin bir örnek toplamak. (B) Numuneyi bir Baermann hunisine batırmak ve solucanların kıvrılıp batmasını beklemek. (C) Huniden tek bir damla serbest bırakma. (D) Plakaları ayırmak için tek hermafroditleri veya çiftleşme dişilerini taşımak. Ramin Rahni tarafından oluşturulan illüstrasyon. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Baermann hunisi her türlü nematod için çalışmaz (belirli alternatifler için Tartışma bölümüne bakın) ve Caenorhabditis veya daha küçük14 boyut aralığında aktif formlar olanlar için en uygun olanıdır. Bununla birlikte, bir çalışma Baermann hunisini kullanabilirse, birçok avantajı vardır. Yöntem, sınırlı kurulum, uygulamalı zaman ve maliyet gerektiren alanda pratiktir. Araştırmacı, plakadaki substratın tıkanmasının olmadan temiz bir örnekle bırakılır, bu da toplamayı kolaylaştırır. Filtre kullanmak ayrıca plakanın, numunedeki nematodları çiğneyen veya avlayan böcek larvaları veya akarları tarafından kirlenmesini önler. En önemlisi, Baermann hunisi, çalışmanın tasarımına bağlı olarak gerekli olabilecek substrat14’ten neredeyse tüm popülasyonu verimli bir şekilde çıkarır. Örneğin, vahşi popülasyonların evresini veya cinsiyet dağılımını saymak, yavaş büyüyen veya nadir genotipler bulmak veya OP50’ye çekmeyen nematodları örneklemekle ilgilenen araştırmacılar bu yöntemden yararlanabilir. Bu, örnekleme şeması örnekleme zamanında popülasyonun bir anlık görüntüsünü aldığından ekolojik17, popülasyon genetiği18 veya metagenetik19 sorularını inceleyen araştırmacılar için uygundur.
Bu makale, Baermann hunisini kullanarak nematod popülasyonlarını izole etmek ve kolay taşıma için seçilen ekipmanları kullanarak alanda izofemale ve izohermafrodit çizgileri oluşturmak için eksiksiz bir protokol tanımlamaktadır. Laboratuvarlarının yakınında saha çalışması yürüten araştırmacılar için, bu adımların çoğu atlanabilir veya basitleştirilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntemin temel prensibi, nematodların suya batırılmış dokudan geçeceği, substratlarının ve daha büyük omurgasız kirleticilerinin geçmeyeceğidir. Protokolün kritik adımları şunlardır: (1) uygun bir substratın toplanması, (2) bir filtreleme malzemesine sarılmış, suya batırılmış, (3) filtreden geçmiş ve suyun dibine batırılmış solucanları toplamak ve (4) tek tek solucanları izofemale veya izohermaphrodite çizgileri oluşturmak için izole etmektir. Yöntemin diğer tüm bölümleri, mevcut kaynaklara, substratların doğasına veya saha çalışması hedeflerine göre gerektiği şekilde değiştirilmeye hazırdır. Dikkate değer bazı değişiklikler aşağıdaki gibidir.
Meyve ekerek solucanları yemleme
Tarla alanında bulunacak çok miktarda bakteri bakımından zengin çürüyen malzeme yoksa, çürümeye bırakmak için bir elma veya domates parçası gibi bir örnek getirmek isteyebilirsiniz. Yemi birkaç kazıkla iyice sabitlayın, böylece daha büyük hayvanlar onları çıkarmaz ve böylece daha sonra toplama için kolayca bulunabilir. Yemin çürümeden önce kuruyabileceği doğrudan güneş ışığından kaçının.
Mevcut malzemelerden huni aparatı yapımı
Boru kelepçesini barındıracak kadar büyük ve üst-ağır bir huniyi destekleyecek kadar kararlı deliklere sahip herhangi bir yapı çalışacaktır. Tek bir huni için, bir içme bardağı uygun bir tutucudur. Yüz dokusu, tuvalet kağıdı veya kağıt havlu gibi her türlü doku kullanılabilir.
Hipoksi veya enfeksiyonu önlemek için hunilere daha az malzeme koymak veya bekleme süresini ayarlamak
Örnek çok yüksek bir solucan veya bakteri konsantrasyonuna sahipse, nematodlar 12 saat inkübasyon tamamlanmadan hipoksi veya enfeksiyondan ölmeye başlayabilir. Bu bir endişe ise, araştırmacı hunileri daha erken kontrol edebilir veya yüksek nüfuslu alt tabakanın çok küçük bir alt örneklemiyle ek bir huni hazırlayabilir.
NGM plaka hazırlamanın deneysel ihtiyaçlara ve kısıtlamalara göre ayarlanması
NGM tabakları deneye uygun medya ve besin kaynağı ne olursa olsun hazırlanabilir. Yukarıda açıklanan alan protokolü bagaj ağırlığını en aza indirmek için tasarlanmıştır. Bagaj sınırlamalarına ve saha çalışması zamanlamasına bağlı olarak, sahaya plaka dökmek yerine laboratuvarda hazırlanmış veya ticari olarak satın alınmış zaten dökülmüş NGM plakaları getirmek tercih edilebilir.
Huni izolasyonlarının laboratuvarda gerçekleştirilmesi
Protokol, nematod popülasyonunun doğada meydana geldiği gibi yakalanması için saha koşullarında prosedürün tamamının gerçekleştirilmesi açıklanmaktadır. Bazı araştırma hedefleri için, nematodları daha sonra, kapalı torbalardaki örneklerle laboratuvara geri döndükten sonra izole etmek yeterli olabilir. O zaman bile, Baermann huni yöntemi, hayatta kalan nematodların diğer izolasyon yöntemlerinden daha temiz ve eksiksiz bir örneğini sağlar. Bununla birlikte, sızdırmaz torbalardaki numuneler, potansiyel aşırı sıcaklık ve hipoksiye maruz kaldıkları için seyahat sırasında seçim yaşayabilir. Bu, numune toplama işleminden sonra mümkün olan en kısa sürede izolasyonlar yapılarak en aza indirilebilir.
Baermann hunisine yaygın bir alternatif yöntem, substratı doğrudan bir NGM plakasına yerleştirmeyi ve solucanların sürünerek çıkmasını beklemeyi içerir, bu da son derece emek yoğundur veya popülasyonun eksik toplanmasıyla sonuçlanır. Ayrıca akarlar ve böcek larvaları ile kontamine olmuş plakalar verir. Baermann huni yöntemi, tüm aktif solucan popülasyonlarını alt tabakalarından hızlı bir şekilde ayırmak için düşük maliyetli, düşük teknolojili, düşük işçilikli bir stratejidir.
Baermann huni yöntemi, her türlü yabani nematodu toplamak için evrensel olarak geçerli değildir. Bazı bitki yaşayan nematodların alt tabakalarından çıkması 12 saatten çok daha uzun sürer ve çok erken salınan bir damlacıkta bulunmazken, bazı böcek parazitleri alttan ziyade huni tepesine sürünerek koleksiyondan da kaçar14. Baermann hunisine alternatifler solucanları kurtarmak için daha özel ekipman veya daha fazla emek gerektirir. Ancak, yukarıdaki uyarılar deney için bir sorunsa, yine de tercih edilebilirler. Van Bezooijen14 tarafından incelenen alternatif seçenekler arasında hunilere sürekli bir su buğusu sağlayan, oksijen ekleyen ve süspansiyondaki bakterilerin taşmasına izin veren huni spreyi yöntemi yer alıyor. Bu, bitkilerden nematodların daha uzun bir ekstraksiyon süresine izin verir. Blender santrifüj yüzdürme yöntemi yavaş hareket etmeyi geri kazandırır, aktif olmayan veya yukarı doğru sürünen nematodları özgül ağırlıklarına göre ayırarak, Oostenbrink elutriator çökeltme tortularını askıya alınmış nematodlardan ayırmak için bir aksaklık uygular ve Cobb’s Method, nematodları boyutlarına, şekillerine ve tortulaşma oranlarına göre izole etmek için bir dizi elek kullanır14. Yine de rabditidleri toplamak için, Baermann hunisi etkili bir şekilde hızlı ve minimum çabayla temiz numuneler üretir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH hibe R35GM141906 ve R21ES031364 ve Damon Runyon Bursu DRG-2371-19 tarafından desteklendi.
Materials
| 1 L glass bottle | NA | NA | Step 1 – vessel for making plate media |
| 1 mL pipette tips | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
| 1 mL pipetter | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
| 35 mm worm plates | Tritech | T3500 | Step 1 – worm plates |
| 4mm ID rubber tubing | Fisher | 14178A | Step 3 – part of the funnel |
| 60 mm worm plates | Greiner | 628161 | Step 1 – worm plates |
| 65 mm Funnel | Fisher | 22170156 | Step 3 – part of the funnel |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | Step 1 – worm plate medium |
| Cooking pot | NA | NA | Step 1 – a water bath for melting the agar to pour plates |
| E. coli strain OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Step 1 – worm food |
| Field microscope | OMAX | G223CS | Step 6 – for viewing worms in the field |
| Fly vial storage tray | Azer Scientific | ES-260T | Step 3 – to build a platform to hold 12 funnels |
| Hot plate or stove | NA | NA | Step 1 – to heat the water bath |
| Kimwipes | KimberlyClark | 34120 | Step 4 – filter for the funnels |
| LB media | Gibco | 10855021 | Step 1 – for growing OP50 |
| Lighter | NA | NA | Step 6 – sterilize the worm pick |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Step 1 – worm plate medium |
| NGM-lite agar | USBiological | N1000 | Step 1 – worm plate medium |
| Parafilm M wrapping film | Fisher | 13-374-10 | Step 6 – pack worm plates for travel |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-500 | Step 1 – worm plate medium |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | P285-3 | Step 1 – worm plate medium |
| scalpel | NA | NA | Step 3 – cut holes for the funnels |
| scissors | NA | NA | Step 3 – cut the rubber tubing |
| Tape | NA | NA | Step 3 – tape the funnel holder together |
| Tubing clamps | Fisher | 5869 | Step 3 – part of the funnel |
| Worm pick | NA | NA | Step 6 – for isolating individual worms |
| Ziplock-style storage bags | NA | NA | Step 2 – to bag a substrate sample |
References
- Frezal, L., Felix, M. A. C. elegans outside the Petri dish. Elife. 4, 05849 (2015).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Reddy, K. C., et al. Antagonistic paralogs control a switch between growth and pathogen resistance in C. elegans. PLOS Pathogens. 15 (1), 1007528 (2019).
- Schulenburg, H., Felix, M. A. The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Andersen, E. C., et al. Chromosome-scale selective sweeps shape Caenorhabditis elegans genomic diversity. Nature Genetics. 44 (3), 285-290 (2012).
- Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource. Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2017).
- Crombie, T. A., et al. Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations. Elife. 8, 50465 (2019).
- Lee, D., et al. Balancing selection maintains hyper-divergent haplotypes in Caenorhabditis elegans. Nature Ecology & Evolution. 5 (6), 794-807 (2021).
- Rockman, M. V., Kruglyak, L. Recombinational landscape and population genomics of Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 5 (3), 1000419 (2009).
- Evans, K. S., van Wijk, M. H., McGrath, P. T., Andersen, E. C., Sterken, M. G. From QTL to gene: C. elegans facilitates discoveries of the genetic mechanisms underlying natural variation. Trends in Genetics. 37, 933-947 (2021).
- Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genetics Research (Cambridge Core). 92 (5-6), 331-348 (2010).
- Noble, L. M., Rockman, M. V., Teotonio, H. Gene-level quantitative trait mapping in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 11 (2), 061 (2021).
- Van Bezooijen, J. . Methods and techniques for nematology. , (2006).
- Barrièrre, A., Félix, M. -. A. Isolation of C. elegans. and related nematodes. Wormbook. , (2014).
- Baermann, G. Eine einfache Methode zur Auffindung von Anklostomum (Nematoden) Larven in Erdproben. Geneeskundig tijdschrift voor Nederlandsch-Indië. 57, 131-137 (1917).
- Gray, N. F. Ecology of nematophagous fungi Panagrellus redivivus as the target organism. Plant and Soil. 297, 293-297 (1983).
- Mallez, S., Castagnone, C., Espada, M., Viera, P., Eisenback, J., Mota, M., Guillemaud, T., Castagnone-Sereno, P. First insights into the genetic diversity of the pinewood nematode in its native area using new polymorphic microsatellite loci. PLOS ONE. 8 (3), 4-11 (2013).
- Kerfahi, D., Tripathi, M. B., Porazinska, L. D., Park, J., Go, R., Adams, M. J. Do tropical rain forest soils have greater nematode diversity than High Arctic tundra? A metagenetic comparison of Malaysia and Svalbard. Global Ecology and Biogeography. 25, 716-728 (2016).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application. PLOS ONE. 16, 0254293 (2021).
- Lints, R., Hall, D. H. Handbook of C. elegans male anatomy. WormAtlas. , (2005).
- Kiontke, K., Félix, M. -. A., Ailion, M., Rockman, M. V., Braendle, C., Pénigault, J. -. B., Fitch, D. H. A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits. BMC Evolutionary Biology. 11, 339 (2011).
