Isolamento Rápido de Nematoides Selvagens por Baermann Funnel
Summary
Este protocolo descreve um método para extrair eficientemente nematoides vivos de substratos naturais no campo.
Abstract
Além de serem organismos modelos experimentais robustos, os caenorhabditis elegans e seus parentes também são animais reais que vivem na natureza. Estudos de nematoides selvagens em seus ambientes naturais são valiosos para entender muitos aspectos da biologia, incluindo os regimes seletivos em que personagens genômicos e fenotípicos distintos evoluem, a base genética para variação de traços complexos e a diversidade genética natural fundamental para todas as populações animais. Este manuscrito descreve um método simples e eficiente para extrair nematoides de seus substratos naturais, incluindo frutas podres, flores, fungos, lixo de folhas e solo. O método do funil baermann, uma técnica clássica de nematologia, isola seletivamente nematoides ativos de seus substratos. Por recuperar quase todos os vermes ativos da amostra, a técnica do funil baermann permite a recuperação de genótipos raros e de crescimento lento que coexistem com genótipos abundantes e de rápido crescimento, que podem ser perdidos em métodos de extração que envolvem várias gerações de reprodução. A técnica também é adequada para abordar questões metagenéticas, populacionais e ecológicas. Captura toda a população em uma amostra simultaneamente, permitindo uma visão imparcial da distribuição natural de idades, sexos e genótipos. O protocolo permite a implantação em escala no campo, convertendo rapidamente substratos em placas de vermes, e os autores validaram-no através do trabalho de campo em vários continentes.
Introduction
Valiosas percepções biológicas estão surgindo à medida que pesquisadores que estudam C. elegans no laboratório expandem seu foco para C. elegans e nematoides de rabditid relacionados na natureza. Estudos de nematoides selvagens colocam genes e genomas em seu contexto natural, revelando funções potencialmente obscurecidas por condições laboratoriais1,2,3,4,5. Esses estudos geram insights sobre o pré-requisito para a própria evolução, variação genética6,7,8,9,10. A variação genética natural capturada por amostras selvagens também fornece incursões na base genética de muitos traços complexos11,12,13.
Ao projetar estudos que requerem o isolamento de populações naturais de nematoides, particularmente na realização de trabalhos de campo remotos, considerações práticas vêm à tona. Este protocolo visa isolar limpamente populações inteiras de nematoides ativos que podem ser cultivadas em OP50 a partir de iscas ou substratos selvagens. O método é adequado para extrair nematoides de rhabditid e diplogasterid de vida livre, incluindo Caenorhabditis, Oscheius e Pristionchus.
Existem muitas técnicas para isolar nematoides de seus substratos14,15. A abordagem mais básica é colocar o substrato diretamente em uma placa nematoides-média, colhendo animais enquanto rastejam para fora8,15. Este método requer grandes quantidades de tempo e trabalho se o objetivo é isolar todos os nematoides de uma amostra. Técnicas mais sofisticadas aproveitam o peso, tamanho, mobilidade ou alguma combinação destes14. Cada método tem suas vantagens e desvantagens em termos de configuração e throughput. Eles também diferem em seus vieses amostrais e podem selecionar para certos nematoides se os animais da amostra variam ao longo do eixo do princípio de separação do método.
O método do funil baermann foi descrito pela primeira vez em 1917 pelo médico holandês G. K. T. F. Baermann, que inventou o dispositivo em Java enquanto estudava nematoides que habitam o solo, incluindo a minhoca parasita16. O funil baermann funciona com base no princípio da mobilidade. O substrato é colocado em um funil forrado com um pano ou filtro de papel (um “Kimwipe” é usado para este estudo, chamado de “limpeza sem fiapos” no protocolo atual) e fechado na parte inferior. O funil é então preenchido com água, submergindo a amostra enquanto o filtro a separa da tomada selada. Nematoides ativos na amostra liberam-se na água e nadam através do filtro, eventualmente se estabelecendo na parte inferior do funil. A saída do funil é aberta, e uma gota de nematoides é expelida em uma placa (Figura 1).
Figura 1: Resumo da técnica do funil Baermann. (A) Coletar uma amostra rica em bactérias de um local de interesse. (B) Submergir a amostra em um funil Baermann e esperar que os vermes se contorcessem e afundassem. (C) Liberando uma única gota do funil. (D) Mover hermafroditas solteiras ou fêmeas acasaladas para separar placas. Ilustração criada por Ramin Rahni. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
O funil Baermann não funcionará para todos os tipos de nematoide (ver seção discussão para alternativas específicas) e é mais adequado àqueles que são formas ativas na faixa de tamanho de Caenorhabditis ou menor14. No entanto, se um estudo pode usar o funil Baermann, há muitas vantagens. O método é prático no campo, exigindo configuração limitada, tempo prático e custo. O pesquisador fica com uma amostra limpa sem a obstrução do substrato na placa, o que facilita a colheita. O uso de um filtro também evita a contaminação da placa por larvas de insetos ou ácaros, que mastigam placas ou presas em nematoides na amostra. Mais importante, o funil Baermann extrai eficientemente quase toda a população do substrato14, o que pode ser necessário dependendo do desenho do estudo. Por exemplo, pesquisadores interessados em contar o estágio ou distribuição sexual de populações selvagens, encontrar genótipos de crescimento lento ou raro, ou amostrar nematoides não atraídos pelo OP50 podem se beneficiar desse método. Isso é apropriado para pesquisadores que estudam questões ecológicas17, genética populacional18 ou metagenética19 , pois o esquema amostral tira um instantâneo da população no momento da amostragem.
O presente manuscrito descreve um protocolo completo para isolar populações de nematoides usando o funil baermann e estabelecer linhas isofemale e isohermafrodita no campo, utilizando equipamentos escolhidos para fácil transporte. Para pesquisadores que realizam trabalhos de campo perto de seus laboratórios, muitas dessas etapas podem ser omitidas ou simplificadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
O princípio central deste método é que os nematoides passarão pelo tecido submerso na água, enquanto seus contaminantes de substrato e invertebrados maiores não passarão. As etapas críticas do protocolo são (1) a coleta de um substrato apropriado, (2) submergir o substrato, envolto em um material filtrante, em água, (3) coletando vermes que passaram pelo filtro e afundaram até o fundo da água, e (4) isolando vermes individuais para criar linhas isofemale ou isohermafrodita. Todas as outras partes do método são favoráveis à modificação conforme necessário de acordo com os recursos disponíveis, a natureza dos substratos ou as metas de trabalho de campo. Algumas modificações que valem a pena considerar são as seguintes.
Isca dos vermes plantando frutas
Se não houver um amplo suprimento de material podre rico em bactérias para ser encontrado no local do campo, pode-se querer trazer uma amostra, como um pedaço de maçã ou tomate, para deixar apodrecer. Fixe a isca bem com algumas estacas para que animais maiores não os removam e assim ele possa ser facilmente encontrado mais tarde para coleta. Evite a luz solar direta, onde a isca pode secar antes de apodrecer.
Construindo aparelhos de funil a partir de qualquer material disponível
Qualquer estrutura com orifícios grandes o suficiente para acomodar o grampo de tubulação e estável o suficiente para suportar um funil pesado funcionará. Para um único funil, um copo de bebida é um suporte adequado. Qualquer tipo de tecido – tecido facial, papel higiênico ou toalhas de papel – pode ser usado.
Colocar menos material em funis, ou ajustar o tempo de espera, para prevenir hipóxia ou infecção
Se a amostra tiver uma concentração muito alta de vermes ou bactérias, nematoides podem começar a morrer de hipóxia ou infecção antes que a incubação de 12 h esteja completa. Se isso for uma preocupação, o pesquisador pode verificar funis mais cedo ou preparar um funil adicional com uma subamostra muito pequena do substrato altamente povoado.
Ajustando a preparação da placa NGM às necessidades e restrições experimentais
As placas de NGM podem ser preparadas com qualquer mídia e fonte de alimento apropriada para o experimento. O protocolo de campo descrito acima foi projetado para minimizar o peso da bagagem. Dependendo das limitações da bagagem e do tempo de trabalho de campo, trazer placas de GNM já derramadas – preparadas em laboratório ou compradas comercialmente – pode ser preferível ao invés de derramar placas no campo.
Realizando os isolamentos do funil no laboratório
O protocolo descreve a realização do procedimento completo em condições de campo para capturar a população de nematoides como ocorre na natureza. Para alguns objetivos de pesquisa, pode ser suficiente para isolar nematoides mais tarde, depois de viajar de volta ao laboratório com amostras em sacos lacrados. Mesmo assim, o método do funil Baermann fornece uma amostra mais limpa e completa dos nematoides sobreviventes do que outros métodos de isolamento. No entanto, amostras em sacos lacrados podem experimentar seleção durante a viagem, pois estão expostas a potenciais extremos de temperatura e hipóxia. Isso pode ser minimizado realizando isolamentos o mais rápido possível após a coleta da amostra.
Um método alternativo comum ao funil Baermann envolve colocar o substrato diretamente em uma placa de NGM e esperar que os vermes se arrastem para fora, o que é altamente trabalhoso ou resulta na coleta incompleta da população. Também produz placas contaminadas com ácaros e larvas de insetos. O método do funil Baermann é uma estratégia de baixa tecnologia e baixa mão-de-obra para separar rapidamente toda a população de vermes ativos de seu substrato.
O método do funil baermann não é universalmente aplicável para coletar todos os tipos de nematoides selvagens. Alguns nematoides que habitam plantas levam muito mais de 12h para emergir de seu substrato e estarão ausentes de uma gotícula liberada muito cedo, enquanto alguns parasitas de insetos rastejarão até o topo do funil em vez da parte inferior, também fugindo da coleta14. Alternativas ao funil Baermann ou exigem equipamentos mais especializados ou mais mão-de-obra para recuperar os vermes. No entanto, eles ainda podem ser preferidos se as ressalvas acima forem um problema para o experimento. Opções alternativas, revisadas por van Bezooijen14, incluem o método de pulverização de funil, que fornece uma névoa constante de água aos funis, adicionando oxigênio e permitindo o transbordamento de bactérias em suspensão. Isso permite um período de extração mais prolongado de nematoides das plantas. O método de flutuação centrífugas do liquidificador recupera nematoides lentos, inativos ou para cima, separando-os por sua gravidade específica, o elutriador de oostenbrink aplica uma corrente para separar sedimentos de nematoides suspensos, e o Método cobb usa uma série de peneiras para isolar nematoides pelo seu tamanho, forma e taxa de sedimentação14. Para coletar rabditids, porém, o funil Baermann produz efetivamente amostras limpas rapidamente e com o mínimo esforço.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelas bolsas NIH R35GM141906 e R21ES031364 e Damon Runyon Fellowship DRG-2371-19.
Materials
| 1 L glass bottle | NA | NA | Step 1 – vessel for making plate media |
| 1 mL pipette tips | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
| 1 mL pipetter | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
| 35 mm worm plates | Tritech | T3500 | Step 1 – worm plates |
| 4mm ID rubber tubing | Fisher | 14178A | Step 3 – part of the funnel |
| 60 mm worm plates | Greiner | 628161 | Step 1 – worm plates |
| 65 mm Funnel | Fisher | 22170156 | Step 3 – part of the funnel |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | Step 1 – worm plate medium |
| Cooking pot | NA | NA | Step 1 – a water bath for melting the agar to pour plates |
| E. coli strain OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Step 1 – worm food |
| Field microscope | OMAX | G223CS | Step 6 – for viewing worms in the field |
| Fly vial storage tray | Azer Scientific | ES-260T | Step 3 – to build a platform to hold 12 funnels |
| Hot plate or stove | NA | NA | Step 1 – to heat the water bath |
| Kimwipes | KimberlyClark | 34120 | Step 4 – filter for the funnels |
| LB media | Gibco | 10855021 | Step 1 – for growing OP50 |
| Lighter | NA | NA | Step 6 – sterilize the worm pick |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Step 1 – worm plate medium |
| NGM-lite agar | USBiological | N1000 | Step 1 – worm plate medium |
| Parafilm M wrapping film | Fisher | 13-374-10 | Step 6 – pack worm plates for travel |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-500 | Step 1 – worm plate medium |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | P285-3 | Step 1 – worm plate medium |
| scalpel | NA | NA | Step 3 – cut holes for the funnels |
| scissors | NA | NA | Step 3 – cut the rubber tubing |
| Tape | NA | NA | Step 3 – tape the funnel holder together |
| Tubing clamps | Fisher | 5869 | Step 3 – part of the funnel |
| Worm pick | NA | NA | Step 6 – for isolating individual worms |
| Ziplock-style storage bags | NA | NA | Step 2 – to bag a substrate sample |
References
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