ベアマン・ファネルによる野生の線虫の迅速な分離

1. フィールド内の播種されたNGMプレートの調製 旅行前に、23.005 gのネマトード成長培地(NGM)( 材料表を参照)の粉末と封止可能なビニール袋のプレパックを計量します。必要なメディアのリットルごとに1袋を作ります。注:旅行前に事前にパッケージングを行う場合、現場での機能バランスの必要性が回避されます。 旅行前に、1M MgSO4の1mL、1M CaCl2の1mL、および1Mリン酸カリウムバッファーの25 mLを必要な各リットルの媒体に対して調製してください。1 L のリン酸カリウムバッファーを作るために、ワームブック20で説明したように KH2PO4 の 108.3 g と K2HPO4 の 35.6 g を水に溶かします。 旅行前に、WormBook20に記載されているように、37 °CでLBで栽培されたOP50(材料表を参照)の一晩培養を行います。50 mL円錐管に培養物をアリコートし、漏れを防ぐためにパラフィンフィルムでトップスを包みます。 現場では、NGMパケットの内容物を、2重蒸留水(ddH20)の973 mLまたは1Lフラスコまたはボトルで入手可能な最も純粋で最も無菌の水に溶解します。 熱い皿またはストーブの熱湯浴に、緩いキャップまたはアルミホイルカバーで、メディアフラスコまたはボトルを置きます。すべての粉末が溶解し、明確になるまで時々かき混ぜます(これは〜30分かかります)。注:磁気ホットプレートが利用可能な場合は、手動攪拌の量を制限するための優れたオプションです。 水浴から媒体を取り出し、時折揺れたり、かき混ぜて~58°Cに冷却します。培地を58°Cに冷却したら、血清学的または標準的なピペットを使用して、1Mリン酸カリウムバッファーの25 mL、1mLの1M MgSO4、1m CaCl2の1 mLを加え、各ステップ間で十分に混合します。 利用可能な最も無菌環境では、ピペットまたは所望のサイズのプレートにメディアを注ぎ、一晩冷却し、固めます。各基板サンプルに60mmプレート(約10mL)を注ぎます。各アイソメスラインに35mmプレート(〜3.5mL)を注ぎます。必要な小皿の数は、事前に予測することは困難です。 OP50培養のピペット50 μLを各プレートに入れ、使用前に一晩乾燥して成長させます。 2. 線虫基板の回収 現場で細菌が豊富な基質を特定します。いくつかの例は、腐った果物、花、真菌、および草本植物の茎を含む。土壌や葉のごみも適していますが、 カエノアハブディティスを含むことはめったにありません。 手袋をはめた手で、この基板のサンプル(1-15 cm3)を、ユニークなサンプルID(図1A)でラベル付けされた密封可能なビニール袋(材料表を参照)に入れます。 サンプルID、緯度、経度、日付、基材の説明、および周囲および基板温度、収集時間、基板の状態、基質関連マクロインバーテブラートの存在など、実験に関連するその他の局所環境測定値を記録します。このプロセス21を合理化するためにスマートフォンアプリが利用可能です。 3. ベアマン漏斗の配列の準備 じょうごごとに、ハサミを使ってゴムチューブのセグメントを切り取ります( 材料表を参照)。 プラスチック漏斗の端にチューブセグメントをフィットさせます( 材料表を参照)。フィット感が非常にタイトであるため、これはいくつかの努力を必要とするかもしれません。 チューブクランプをゴムチューブの上にスライドさせ、締め付けます。 漏斗のホールを作るためには、平らな出荷の向きから一緒に折り畳まれていない段ボールフライバイアルトレイ( 材料表を参照)の底部に直径35mmの円形の穴を切断するためにメスを使用します。標準トレイは、3 x 4アレイにこれらの穴の12を収容することができます。 段ボールを反転し、側面を1回折りたたみ(フライバイアルトレイを作るように2回ではない)、側面をテープでつなぎ、逆段ボールトレイを高めます(図2)。 穴に漏斗を置き、まずチューブクランプが閉じた位置にあることを確認します。 図2:段ボールフライバイアルトレイ、折り畳み、カットを行い、それぞれ12台のBaermannファネルをサポートします。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 4. 漏斗へのサンプルの転送 各漏斗に水(利用可能な限り無菌)を注ぎ、リムの約3cm下に充填します。気泡がチューブに閉じ込められている場合は、漏斗をタップして放出します。 手袋をはめた手で、漏斗の上に糸くずのないワイプまたは具体的にキムワイプ(正方形を作るために半分に折りたたむ)を置き、水に沈むように中央を押し下きます。 手動で自然の基質(果物、花、土壌、葉のごみなど)の大きな固体部分を小さな断片に分割し、ワームが基板から落下するために移動しなければならない距離を最小限に抑えます。注:葉のごみやぎこちない形のサンプルは、フードプロセッサーやブレンダーで前処理することができます。 天然基質(1-15 cm3)のサンプルを、組織を穿刺することなく、リムの上にサンプルが突き出ることなく、漏斗の中の組織/糸くずのないワイプの上にそっと置きます。 フィールド コレクション メモに対応するサンプル ID を使用して、じょうごまたはじょうごの横の段ボールにラベルを付けます。 サンプルの上にティッシュ/糸くずのワイプの角を折ります(図1B)。土壌や破片が漏斗の底に通過しないように、組織/糸くずのない拭き取りに含まれるサンプルを保管するように注意してください。注:このステップは、角が漏斗の端にドレープするのを防ぐためで、漏斗の側面から水を吸い取ります。 手、へら、またはピペットの先端で、漏斗から漏斗、交差汚染サンプルに移動する可能性のある活性昆虫、ミリペデス、または他の動物を選び出します。サンプルの周りにティッシュ/糸くずのないワイプを完全に包むか、クロス汚染を防ぐためにサンプルの上部に第2のティッシュを置く。 サンプル全体を水没させるために、漏斗にさらに水を追加します(図3)。 図3:ベアマンファネルを組み立てた。 各サンプルはティッシュ/糸くずのないワイプで包まれ、漏斗の水の下に沈め、締め付けられる。12時間の期間にわたって、線虫は組織を通って漏斗の底に移動します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 5. 漏斗からの線虫の抽出 〜12時間または一晩待ちます。この間、アクティブワームは、組織/糸くずのないワイプを介して、クランプされた漏斗の底まで、基質からくねくねします。注:12時間よりずっと長く待つことは、低酸素症や病原性感染によるワームの死亡を危険にさらし、特にワームや細菌で混雑しているサンプルの期間が短い場合にもリスクがあります。 OP50 大腸菌 のスポットで播種された60mm NGMワームプレートの底に漏斗のサンプルIDを書きます。プレートから蓋を取り外します。 そのサンプルを含む漏斗を漏斗スタンドから取り外します。一方の手で漏斗を開いたワームプレートの上に直立させ、もう一方の手でチューブクランプの圧力を解放し、一滴の水がチューブからワームプレートに落ちるようにします(図1C)。漏斗から水が落ちるとすぐに、NGMプレートの洪水を防ぐためにすぐに再び閉じます。注: カエノハブディティス 種を含むOP50に引き付けられたワームを選択するには、細菌の芝生から離れてドロップを解放します。水がプレートに浸かるか、蒸発すると、 カエノーハブディティス 線虫は細菌の芝生に這い込みます。 クリーンアップ:漏斗の内容を捨てる。その後の再利用のために、お湯で漏斗を洗います。 6. 文化の確立 5x-50倍の倍率で、離れた線虫を実体顕微鏡で観察します。プレートには線虫を含め、はるかに低い周波数では、小さなオリゴカイト・アンネリド、タージグレード、ロティファー、および小さな甲殻類を含める必要があります(図4)。注:漏斗が正しく設定されている場合、ミコン、昆虫、または目に見える生きている材料は漏斗を通してそれを作っていないでしょう。 図4:バーマンの漏斗からNGMプレートに最初に放出された液滴の内容物。 アイソヘマフロダイトまたはアイソメスラインを確立するには、ワームピックを使用して、各L4雌雄同体または交配した成人女性(より大きな体の大きさと雄の尾部の欠如によって認識可能)をOP50で播種された別の35mm NGMプレートに移します(図1D)。ワームを転送する前と後にワームピックを殺菌するためにライターを使用してください。 パラフィンフィルムを使用して、プレートを十分にラップして移動します。