Schnelle Isolierung wilder Nematoden durch Baermann Funnel
Summary
Dieses Protokoll skizziert eine Methode zur effizienten Extraktion lebender Nematoden aus natürlichen Substraten im Feld.
Abstract
Caenorhabditis elegans und seine Verwandten sind nicht nur robuste experimentelle Modellorganismen, sondern auch echte Tiere, die in der Natur leben. Studien an wilden Nematoden in ihrer natürlichen Umgebung sind wertvoll für das Verständnis vieler Aspekte der Biologie, einschließlich der selektiven Regime, in denen sich unverwechselbare genomische und phänotypische Charaktere entwickeln, der genetischen Grundlage für komplexe Merkmalsvariationen und der natürlichen genetischen Vielfalt, die für alle Tierpopulationen von grundlegender Bedeutung ist. Dieses Manuskript beschreibt eine einfache und effiziente Methode zur Extraktion von Nematoden aus ihren natürlichen Substraten, einschließlich verrottender Früchte, Blumen, Pilze, Laubstreu und Erde. Die Baermann-Trichtermethode, eine klassische nematologische Technik, isoliert selektiv aktive Nematoden aus ihren Substraten. Da fast alle aktiven Würmer aus der Probe gewonnen werden, ermöglicht die Baermann-Trichtertechnik die Wiederherstellung seltener und langsam wachsender Genotypen, die zusammen mit reichlich vorhandenen und schnell wachsenden Genotypen auftreten, die bei Extraktionsmethoden, die mehrere Generationen der Fortpflanzung beinhalten, übersehen werden könnten. Die Technik eignet sich auch gut, um metagenetische, populationsgenetische und ökologische Fragen zu beantworten. Es erfasst die gesamte Population gleichzeitig in einer Stichprobe und ermöglicht so einen unvoreingenommenen Blick auf die natürliche Verteilung von Alter, Geschlecht und Genotypen. Das Protokoll ermöglicht den Einsatz im großen Maßstab im Feld, die schnelle Umwandlung von Substraten in Schneckenplatten, und die Autoren haben es durch Feldforschung auf mehreren Kontinenten validiert.
Introduction
Wertvolle biologische Erkenntnisse zeichnen sich ab, da Forscher, die C. elegans im Labor untersuchen, ihren Fokus auf C. elegans und verwandte rhabditide Nematoden in freier Wildbahn ausdehnen. Studien an wilden Nematoden stellen Gene und Genome in ihren natürlichen Kontext und enthüllen Funktionen, die möglicherweise durch Laborbedingungen verdeckt werden1,2,3,4,5. Diese Studien liefern Erkenntnisse über die Voraussetzungen für die Evolution selbst, die genetische Variation6,7,8,9,10. Die natürliche genetische Variation, die von Wildproben erfasst wird, bietet auch Einblicke in die genetische Grundlage vieler komplexer Merkmale11,12,13.
Bei der Gestaltung von Studien, die die Isolierung natürlicher Populationen von Nematoden erfordern, insbesondere bei der Durchführung von Fernfeldarbeit, treten praktische Überlegungen in den Vordergrund. Dieses Protokoll zielt darauf ab, ganze Populationen aktiver Nematoden, die auf OP50 kultiviert werden können, aus Ködern oder wilden Substraten sauber zu isolieren. Die Methode eignet sich gut zur Extraktion freilebender Rhabditiden und Diplogasteriden, einschließlich Caenorhabditis, Oscheius und Pristionchus.
Es gibt viele Techniken, um Nematoden von ihren Substraten zu isolieren14,15. Der grundlegendste Ansatz besteht darin, das Substrat direkt auf eine Nematoden-medium-Platte zu legen und Tiere zu pflücken, während sie herauskriechen8,15. Diese Methode erfordert viel Zeit und Arbeit, wenn das Ziel darin besteht, alle Nematoden aus einer Probe zu isolieren. Ausgefeiltere Techniken nutzen das Gewicht, die Größe, die Mobilität oder eine Kombination davon der Tiere aus14. Jede Methode hat ihre Vor- und Nachteile in Bezug auf Einrichtung und Durchsatz. Sie unterscheiden sich auch in ihren Stichprobenverzerrungen und können für bestimmte Nematoden selektieren, wenn die Tiere in der Probe entlang der Achse des Trennprinzips der Methode variieren.
Die Baermann-Trichtermethode wurde erstmals 1917 vom niederländischen Arzt G. K. T. F. Baermann beschrieben, der das Gerät auf Java erfand, während er bodenbewohnende Nematoden, einschließlich des parasitären Hakenwurms, untersuchte16. Der Baermann Funnel funktioniert nach dem Prinzip der Mobilität. Das Substrat wird in einen Trichter gegeben, der mit einem Stoff- oder Papierfilter ausgekleidet ist (für diese Studie wird ein “Kimwipe” verwendet, im aktuellen Protokoll als “fusselfreies Tuch” bezeichnet) und unten verschlossen verschlossen. Der Trichter wird dann mit Wasser gefüllt und taucht die Probe ein, während der Filter sie vom versiegelten Auslass trennt. Aktive Nematoden in der Probe geben sich selbst ins Wasser ab und schwimmen durch den Filter, wobei sie sich schließlich am Boden des Trichters absetzen. Der Trichterauslass wird geöffnet und ein Tropfen Nematoden wird auf eine Platte ausgestoßen (Abbildung 1).
Abbildung 1: Zusammenfassung der Baermann-Trichtertechnik. (A) Sammeln einer bakterienreichen Probe von einer interessanten Stelle. (B) Die Probe wird in einen Baermann-Trichter getaucht und wartet darauf, dass sich Würmer herauswinden und sinken. (C) Loslassen eines einzelnen Tropfens aus dem Trichter. (D) Bewegen einzelner Hermaphroditen oder gepaarter Weibchen auf getrennte Platten. Illustration erstellt von Ramin Rahni. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Der Baermann-Trichter funktioniert nicht für jede Art von Nematoden (siehe Diskussionsabschnitt für spezifische Alternativen) und eignet sich am besten für diejenigen, die aktive Formen im Größenbereich von Caenorhabditis oder kleiner sind14. Wenn eine Studie jedoch den Baermann-Trichter nutzen kann, gibt es viele Vorteile. Die Methode ist praktisch im Feld und erfordert eine begrenzte Einrichtung, praktische Zeit und Kosten. Dem Forscher bleibt eine saubere Probe ohne die Behinderung des Substrats auf der Platte, was die Kommissionierung erleichtert. Die Verwendung eines Filters verhindert auch die Kontamination der Platte durch Insektenlarven oder Milben, die Platten kauen oder Nematoden in der Probe erbeuten. Am wichtigsten ist, dass der Baermann-Trichter effizient fast die gesamte Population aus dem Substrat extrahiert14, was je nach Studiendesign erforderlich sein kann. Zum Beispiel könnten Forscher, die daran interessiert sind, das Stadium oder die Geschlechtsverteilung wilder Populationen zu zählen, langsam wachsende oder seltene Genotypen zu finden oder Nematoden zu beproben, die nicht von OP50 angezogen werden, von dieser Methode profitieren. Dies ist für Forscher geeignet, die ökologische17, populationsgenetische18 oder metagenetische19 Fragen untersuchen, da das Stichprobenschema eine Momentaufnahme der Population zum Stichprobenzeitpunkt erstellt.
Das vorliegende Manuskript beschreibt ein vollständiges Protokoll zur Isolierung von Nematodenpopulationen unter Verwendung des Baermann-Trichters und zur Etablierung von Isofemale- und Isohermaphroditlinien im Feld unter Verwendung von Geräten, die für einen einfachen Transport ausgewählt wurden. Für Forscher, die Feldforschung in der Nähe ihrer Labore durchführen, können viele dieser Schritte weggelassen oder vereinfacht werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das zentrale Prinzip dieser Methode besteht darin, dass Nematoden das in Wasser getauchte Gewebe passieren, während ihr Substrat und größere wirbellose Verunreinigungen dies nicht tun. Die kritischen Schritte des Protokolls sind (1) das Sammeln eines geeigneten Substrats, (2) das Eintauchen des in ein Filtermaterial eingewickelten Substrats in Wasser, (3) das Sammeln von Würmern, die den Filter passiert haben und auf den Boden des Wassers gesunken sind, und (4) die Isolierung einzelner Würmer, um isofemale oder isohermaphrodite Linien zu erzeugen. Alle anderen Teile der Methode können je nach den verfügbaren Ressourcen, der Art der Substrate oder den Feldarbeitszielen bei Bedarf modifiziert werden. Einige Änderungen, die es wert sind, in Betracht gezogen zu werden, sind wie folgt.
Ködern der Würmer durch Pflanzen von Früchten
Wenn auf dem Feldgelände kein ausreichendes Angebot an bakterienreichem Fäulnismaterial vorhanden ist, kann man eine Probe, wie ein Stück Apfel oder eine Tomate, mitbringen, um sie verrotten zu lassen. Stecken Sie den Köder gut mit ein paar Pfählen fest, damit größere Tiere ihn nicht entfernen und so später leicht zur Abholung gefunden werden kann. Vermeiden Sie direkte Sonneneinstrahlung, bei der der Köder trocknen könnte, bevor er verrottet.
Trichterapparatur aus allen verfügbaren Materialien konstruieren
Jede Struktur mit Löchern, die groß genug sind, um die Rohrklemme aufzunehmen, und stabil genug, um einen kopflastigen Trichter zu tragen, funktioniert. Für einen einzelnen Trichter ist ein Trinkglas ein geeigneter Halter. Jede Art von Taschentuch – Gesichtstücher, Toilettenpapier oder Papierhandtücher – kann verwendet werden.
Weniger Material in Trichter geben oder die Wartezeit anpassen, um Hypoxie oder Infektionen zu verhindern
Wenn die Probe eine sehr hohe Konzentration an Würmern oder Bakterien aufweist, können Nematoden an Hypoxie oder Infektion sterben, bevor die 12-stündige Inkubation abgeschlossen ist. Wenn dies ein Problem darstellt, kann der Forscher die Trichter früher überprüfen oder einen zusätzlichen Trichter mit einer sehr kleinen Teilstichprobe des dicht besiedelten Substrats vorbereiten.
Anpassung der NGM-Plattenvorbereitung an experimentelle Bedürfnisse und Einschränkungen
NGM-Platten können mit jedem Medium und jeder Nahrungsquelle zubereitet werden, die für das Experiment geeignet sind. Das oben beschriebene Feldprotokoll wurde entwickelt, um das Gepäckgewicht zu minimieren. Abhängig von den Gepäckbeschränkungen und dem Zeitpunkt der Feldarbeit kann das Mitbringen bereits gegossener NGM-Platten – entweder im Labor vorbereitet oder kommerziell gekauft – dem Ausgießen von Platten im Feld vorzuziehen sein.
Durchführung der Trichterisolierungen im Labor
Das Protokoll beschreibt die Durchführung des gesamten Verfahrens unter Feldbedingungen, um die Nematodenpopulation so zu erfassen, wie sie in der Natur vorkommt. Für einige Forschungsziele kann es ausreichen, Nematoden später zu isolieren, nachdem sie mit Proben in versiegelten Beuteln ins Labor zurückgekehrt sind. Selbst dann liefert die Baermann-Trichtermethode eine sauberere und vollständige Probe der überlebenden Nematoden als andere Isolationsmethoden. Proben in versiegelten Beuteln können jedoch während der Reise ausgewählt werden, da sie potenziellen Extremen von Temperatur und Hypoxie ausgesetzt sind. Dies kann minimiert werden, indem so schnell wie möglich nach der Probenentnahme Isolierungen durchgeführt werden.
Eine gängige Alternative zum Baermann-Trichter besteht darin, das Substrat direkt auf eine NGM-Platte zu legen und darauf zu warten, dass Würmer herauskriechen, was entweder sehr arbeitsintensiv ist oder zu einer unvollständigen Sammlung der Population führt. Es liefert auch Platten, die mit Milben und Insektenlarven kontaminiert sind. Die Baermann-Trichtermethode ist eine kostengünstige Low-Tech- und Low-Labor-Strategie, um die gesamte Population aktiver Würmer schnell von ihrem Substrat zu trennen.
Die Baermann-Trichtermethode ist nicht universell für die Sammlung aller Arten von wilden Nematoden anwendbar. Einige pflanzenbewohnende Nematoden brauchen viel länger als 12 h, um aus ihrem Substrat auszutreten, und fehlen in einem zu früh freigesetzten Tröpfchen, während einige Insektenparasiten eher an die Spitze des Trichters als an den Boden kriechen und sich ebenfalls der Sammlung entziehen14. Alternativen zum Baermann-Trichter erfordern entweder eine speziellere Ausrüstung oder mehr Arbeit, um die Würmer zu bergen. Sie können jedoch immer noch bevorzugt werden, wenn die oben genannten Vorbehalte ein Problem für das Experiment darstellen. Alternative Optionen, die von van Bezooijen14 überprüft wurden, umfassen die Trichtersprühmethode, die den Trichtern einen konstanten Wassernebel zur Verfügung stellt, Sauerstoff hinzufügt und den Überlauf von Bakterien in Suspension ermöglicht. Dies ermöglicht eine längere Extraktionsdauer von Nematoden aus Pflanzen. Die Blender-Zentrifugalflotationsmethode gewinnt langsam bewegende, inaktive oder nach oben kriechende Nematoden zurück, indem sie nach ihrem spezifischen Gewicht getrennt werden, der Oostenbrink-Elutriator wendet eine Unterströmung an, um sedimentierende Sedimente von suspendierten Nematoden zu trennen, und Cobbs Methode verwendet eine Reihe von Sieben, um Nematoden nach ihrer Größe, Form und Sedimentationsrate zu isolieren14. Um Rhabditiden zu sammeln, produziert der Baermann-Trichter jedoch effektiv saubere Proben schnell und mit minimalem Aufwand.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse R35GM141906 und R21ES031364 sowie das Damon Runyon Fellowship DRG-2371-19 unterstützt.
Materials
| 1 L glass bottle | NA | NA | Step 1 – vessel for making plate media |
| 1 mL pipette tips | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
| 1 mL pipetter | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
| 35 mm worm plates | Tritech | T3500 | Step 1 – worm plates |
| 4mm ID rubber tubing | Fisher | 14178A | Step 3 – part of the funnel |
| 60 mm worm plates | Greiner | 628161 | Step 1 – worm plates |
| 65 mm Funnel | Fisher | 22170156 | Step 3 – part of the funnel |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | Step 1 – worm plate medium |
| Cooking pot | NA | NA | Step 1 – a water bath for melting the agar to pour plates |
| E. coli strain OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Step 1 – worm food |
| Field microscope | OMAX | G223CS | Step 6 – for viewing worms in the field |
| Fly vial storage tray | Azer Scientific | ES-260T | Step 3 – to build a platform to hold 12 funnels |
| Hot plate or stove | NA | NA | Step 1 – to heat the water bath |
| Kimwipes | KimberlyClark | 34120 | Step 4 – filter for the funnels |
| LB media | Gibco | 10855021 | Step 1 – for growing OP50 |
| Lighter | NA | NA | Step 6 – sterilize the worm pick |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Step 1 – worm plate medium |
| NGM-lite agar | USBiological | N1000 | Step 1 – worm plate medium |
| Parafilm M wrapping film | Fisher | 13-374-10 | Step 6 – pack worm plates for travel |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-500 | Step 1 – worm plate medium |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | P285-3 | Step 1 – worm plate medium |
| scalpel | NA | NA | Step 3 – cut holes for the funnels |
| scissors | NA | NA | Step 3 – cut the rubber tubing |
| Tape | NA | NA | Step 3 – tape the funnel holder together |
| Tubing clamps | Fisher | 5869 | Step 3 – part of the funnel |
| Worm pick | NA | NA | Step 6 – for isolating individual worms |
| Ziplock-style storage bags | NA | NA | Step 2 – to bag a substrate sample |
References
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