由Baermann Funnel快速分离野生线虫

1. 在田间制备种子NGM板 旅行前，称取 23.005 克线虫生长培养基 （NGM）粉末（见 材料表），并预先装在可密封的塑料袋中。为每升所需介质制作一个袋子。注：旅行前预先包装，无需在现场进行功能平衡。 旅行前，为每升所需培养基准备 1 mL 1M MgSO4、1 mL 1M CaCl2 和 25 mL 1M 磷酸钾缓冲液。要制作1L磷酸钾缓冲液，请将108.3gKH2PO4和35.6gK2HPO4溶解在水中，如WormBook20中所述。 在旅行之前，按照WormBook20中所述，在37°C的LB中生长OP50（见材料表）进行过夜培养。将培养物等分到50mL锥形管中，并用石蜡膜包裹顶部以防止泄漏。 在现场，将NGM包的内容物溶解到973毫升双蒸馏水（ddH20）或1升烧瓶或瓶中最纯净，最无菌的水中。 将带有松散盖子或铝箔盖的培养基瓶或瓶子放在热板或炉子上的沸腾热水浴中。偶尔搅拌，直到所有粉末溶解并变清（这需要约30分钟）。注意：如果有磁性热板可用，搅拌棒是限制手动搅拌量的绝佳选择。 从水浴中取出介质，冷却至~58°C，偶尔摇晃或搅拌棒。一旦培养基冷却至58°C，使用血清学或标准移液管加入25mL磷酸钾缓冲液，1mL1M MgSO4和1mL1M CaCl2，在每个步骤之间充分混合。 在最无菌的环境中，将培养基移液或倒入所需尺寸的板中，并冷却并固化过夜。为每个底物样品倒入一个60 mm板（约10 mL）。为每条等离子管路倒入一块35毫米板（~3.5毫升）;所需的小板的数量很难提前预测。 将50μL OP50培养物移入每个板上，并在使用前使其干燥并生长过夜。 2. 线虫基质的收集 在现场识别富含细菌的底物。一些例子包括腐烂的水果，花朵，真菌和草本植物的茎。土壤和落叶也是合适的，尽管它们很少含有 Caenorhabditis。 用戴手套的手，将该基质的样品（1-15 cm3）放入标有唯一样品ID的可密封塑料袋（见 材料表）中（图1A）。 记录样品ID，纬度，经度，日期，底物的描述以及与实验相关的任何其他局部环境测量，包括环境和底物温度，收集时间，底物状况，底物相关大型无脊椎动物的存在等。智能手机应用程序可用于简化此过程21。 3. 准备一系列贝尔曼漏斗 对于每个漏斗，使用剪刀切割一段长约3厘米的橡胶管（见 材料表）。 将管段安装在塑料漏斗的末端（请参见 材料表）。这可能需要一些努力，因为配合非常紧密。 将卡套管夹滑过橡胶管并将其夹紧。 要制作漏斗架，请使用手术刀在纸板飞瓶托盘（见 材料表）的底部切割直径为35毫米的圆孔，该托盘尚未从其平坦的运输方向折叠在一起。标准托盘可容纳 3 x 4 阵列中的 12 个此类孔。 倒置纸板，将侧面向下折叠一次（而不是两次，就像制作飞瓶托盘那样），然后将侧面粘在一起以抬高倒置的纸板托盘（图2）。 在孔中放置漏斗，首先确保卡套管夹处于关闭位置。 图 2：重新利用的纸板飞碟托盘，折叠和切割以支撑每个 12 个 Baermann 漏斗。 请点击此处查看此图的放大版本。 4. 将样品转移到漏斗中 将水（尽可能无菌）倒入每个漏斗中，将其填充到边缘以下约3厘米处。如果气泡被困在管道中，请点击漏斗以释放它们。 用戴手套的手，在漏斗上放一个不起毛的湿巾或特别是一个Kimwipe（折叠成两半做成一个正方形），然后向下按压中心，使其浸入水中。 手动将大型固体天然基质（水果，花朵，土壤，落叶等）破碎成较小的碎片，以最大限度地减少蠕虫必须从基质中脱落的距离。注意：落叶和形状笨拙的样品可以在食品加工机或搅拌机中进行预处理。 将天然基质（1-15 cm3）样品轻轻地放在漏斗中的组织/无绒擦拭布上，而不刺穿组织，也不要样品突出边缘上方。 在漏斗或漏斗旁边的纸板上贴上标签，并使用与现场收集注释相对应的样品 ID。 将组织的角/无绒擦拭布折叠在样品上（图1B）。小心将样品保持在组织/无绒擦拭内，以免污垢或碎屑进入漏斗底部。注意：此步骤是为了防止角落覆盖在漏斗的边缘，在那里它们会从漏斗中排出两侧的水。 用手、刮刀或移液器吸头，挑出任何活跃的昆虫、千足虫或其他动物，这些动物可能从一个漏斗移动到另一个漏斗，交叉污染样品。将组织/无绒擦拭巾完全包裹在样品周围，或在样品顶部放置第二个组织，以防止交叉污染。 向漏斗中加入更多的水，使整个样品被淹没（图3）。 图 3：组装好的贝尔曼漏斗。 将每个样品包裹在无组织/无绒擦拭物中，并浸没在漏斗中的水下，漏斗被夹紧。在约12小时的时间内，线虫将通过组织迁移到漏斗的底部。 请点击此处查看此图的放大版本。 5. 从漏斗中提取线虫 等待约12小时或过夜。在此期间，活跃的蠕虫会从基质中蠕动出来，通过组织/无绒擦拭物，并下降到夹紧漏斗的底部。注意：等待时间超过12小时有蠕虫死亡的风险，因为缺氧或致病性感染，对于特别拥挤蠕虫和细菌的样品，在较短的持续时间内也可能是一种风险。 将漏斗的样品ID写在60毫米NGM蠕虫板的底部，该虫板接种了OP50 大肠杆菌 的斑点。从盘子上取下盖子。 从漏斗支架中取出包含该样品的漏斗。用一只手将漏斗直立在打开的蜗杆板上方，另一只手释放管夹上的压力，让一滴水从管子落到蜗杆板上（图1C）。一旦水从漏斗中滴落，请迅速将其再次夹紧，以防止淹没NGM板。注意：要选择被OP50吸引的蠕虫，包括 Caenorhabditis 物种，请从细菌草坪上释放液滴。当水渗入板中或蒸发时， 线 虫会爬进细菌草坪。 清理：丢弃漏斗的内容。用热水清洗漏斗，以便随后重复使用。 6. 建立文化 在立体显微镜下以5x-50x的放大倍率观察孤立的线虫。板应包括线虫，并且在低得多的频率下，小寡毛纲动物annelyids，缓步动物，轮虫和小型甲壳类动物（图4）。注意：如果漏斗设置正确，则没有螨虫，昆虫或可见的非生物物质会通过漏斗。 图 4：从 Baermann 漏斗释放到 NGM 板上的第一个液滴的内容。请单击此处查看此图的放大图。 要建立等雌雄同体或异雌雄同体系，使用蠕虫镐将每个L4雌雄同体或交配的成年雌性（通过其较大的体型和缺乏独特的雄性尾巴22可识别）转移到带有OP50播种的单独的35 mm NGM板中（图1D）。在转移蠕虫之前和之后，使用打火机对蠕虫进行消毒。 使用石蜡膜彻底包裹板材以方便旅行。