Snelle isolatie van wilde nematoden door Baermann Funnel
Summary
Dit protocol schetst een methode voor het efficiënt extraheren van levende nematoden uit natuurlijke substraten in het veld.
Abstract
Naast robuuste experimentele modelorganismen zijn Caenorhabditis elegans en zijn verwanten ook echte dieren die in de natuur leven. Studies van wilde nematoden in hun natuurlijke omgeving zijn waardevol voor het begrijpen van vele aspecten van de biologie, waaronder de selectieve regimes waarin onderscheidende genomische en fenotypische karakters evolueren, de genetische basis voor complexe variatie in eigenschappen en de natuurlijke genetische diversiteit die fundamenteel is voor alle dierpopulaties. Dit manuscript beschrijft een eenvoudige en efficiënte methode voor het extraheren van nematoden uit hun natuurlijke substraten, waaronder rottende vruchten, bloemen, schimmels, bladafval en grond. De Baermann trechtermethode, een klassieke nematologietechniek, isoleert selectief actieve nematoden uit hun substraten. Omdat het bijna alle actieve wormen uit het monster herstelt, maakt de Baermann-trechtertechniek het herstel mogelijk van zeldzame en langzaam groeiende genotypen die samen voorkomen met overvloedige en snelgroeiende genotypen, die kunnen worden gemist in extractiemethoden waarbij meerdere generaties reproductie betrokken zijn. De techniek is ook zeer geschikt om metagenetische, populatie-genetische en ecologische vragen aan te pakken. Het vangt de hele populatie tegelijkertijd in een steekproef, waardoor een onbevooroordeeld beeld ontstaat van de natuurlijke verdeling van leeftijden, geslachten en genotypen. Het protocol maakt inzet op schaal in het veld mogelijk, waarbij substraten snel worden omgezet in wormplaten, en de auteurs hebben het gevalideerd door veldwerk op meerdere continenten.
Introduction
Waardevolle biologische inzichten komen naar voren als onderzoekers die C. elegans in het laboratorium bestuderen hun focus uitbreiden naar C. elegans en gerelateerde rhabditid-nematoden in het wild. Studies van wilde nematoden plaatsen genen en genomen in hun natuurlijke context en onthullen functies die mogelijk worden verduisterd door laboratoriumomstandigheden1,2,3,4,5. Deze studies genereren inzicht in de voorwaarde voor evolutie zelf, genetische variatie6,7,8,9,10. De natuurlijke genetische variatie die door wilde monsters wordt vastgelegd, biedt ook ingangen in de genetische basis van veel complexe eigenschappen11,12,13.
Bij het ontwerpen van studies die de isolatie van natuurlijke populaties van nematoden vereisen, met name bij het uitvoeren van veldwerk op afstand, komen praktische overwegingen naar voren. Dit protocol is bedoeld om hele populaties actieve nematoden die op OP50 kunnen worden gekweekt, netjes te isoleren van aas of wilde substraten. De methode is zeer geschikt voor het extraheren van vrijlevende rhabditid en diplogasterid nematoden, waaronder Caenorhabditis, Oscheius en Pristionchus.
Er zijn veel technieken om nematoden te isoleren van hun substraten14,15. De meest basale benadering is om het substraat direct op een nematode-medium plaat te plaatsen en dieren te plukken terwijl ze eruit kruipen8,15. Deze methode vereist grote hoeveelheden tijd en arbeid als het doel is om alle nematoden uit een monster te isoleren. Meer geavanceerde technieken maken gebruik van het gewicht, de grootte, de mobiliteit of een combinatie van deze dieren14. Elke methode heeft zijn voor- en nadelen op het gebied van installatie en doorvoer. Ze verschillen ook in hun bemonsteringsbias en kunnen voor bepaalde nematoden kiezen als de dieren in het monster variëren langs de as van het scheidingsprincipe van de methode.
De Baermann-trechtermethode werd voor het eerst beschreven in 1917 door de Nederlandse arts G. K. T. F. Baermann, die het apparaat op Java uitvond tijdens het bestuderen van bodembewonende nematoden, waaronder de parasitaire haakworm16. De Baermann trechter functioneert op basis van het principe van mobiliteit. Het substraat wordt in een trechter geplaatst die is bekleed met een doek of papieren filter (voor deze studie wordt een “Kimwipe” gebruikt, in het huidige protocol “pluisvrij doekje” genoemd) en aan de onderkant dichtgedicht. De trechter wordt vervolgens gevuld met water, waardoor het monster wordt ondergedompeld terwijl het filter het scheidt van de afgesloten uitlaat. Actieve nematoden in het monster laten zich los in het water en zwemmen door het filter en bezinken uiteindelijk op de bodem van de trechter. De trechteruitlaat wordt geopend en een druppel nematoden wordt op een plaat uitgestoten (figuur 1).
Figuur 1: Samenvatting van de Baermann-trechtertechniek. (A) Het verzamelen van een bacterierijk monster van een interessante locatie. (B) Het monster onderdompelen in een Baermann-trechter en wachten tot de wormen eruit wringen en zinken. (C) Het vrijgeven van een enkele druppel uit de trechter. (D) Het verplaatsen van enkele hermafrodieten of gepaarde vrouwtjes naar afzonderlijke platen. Illustratie gemaakt door Ramin Rahni. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De Baermann-trechter werkt niet voor elk soort nematode (zie het gedeelte Discussie voor specifieke alternatieven) en is het meest geschikt voor die actieve vormen in het groottebereik van Caenorhabditis of kleiner14. Als een studie echter de Baermann-trechter kan gebruiken, zijn er veel voordelen. De methode is praktisch in het veld en vereist beperkte installatie, hands-on tijd en kosten. De onderzoeker blijft achter met een schoon monster zonder de obstructie van het substraat op de plaat, wat het plukken gemakkelijk maakt. Het gebruik van een filter voorkomt ook besmetting van de plaat door insectenlarven of mijten, die borden kauwen of jagen op nematoden in het monster. Het belangrijkste is dat de Baermann-trechter bijna de hele populatie efficiënt uit het substraat haalt14, wat nodig kan zijn afhankelijk van het ontwerp van de studie. Onderzoekers die bijvoorbeeld geïnteresseerd zijn in het tellen van het stadium of de geslachtsverdeling van wilde populaties, het vinden van langzaam groeiende of zeldzame genotypen of het bemonsteren van nematoden die niet worden aangetrokken door OP50, kunnen baat hebben bij deze methode. Dit is geschikt voor onderzoekers die ecologische17, populatiegenetische18 of metagenetische19 vragen bestuderen, omdat het bemonsteringsschema een momentopname maakt van de populatie op het bemonsteringstijdstip.
Het huidige manuscript beschrijft een compleet protocol voor het isoleren van populaties van nematoden met behulp van de Baermann-trechter en het vaststellen van isofemale- en isohermafrodietlijnen in het veld, met behulp van apparatuur die is gekozen voor eenvoudig transport. Voor onderzoekers die veldwerk uitvoeren in de buurt van hun laboratoria, kunnen veel van deze stappen worden weggelaten of vereenvoudigd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het centrale principe van deze methode is dat nematoden door het weefsel gaan dat ondergedompeld is in water, terwijl hun substraat en grotere ongewervelde verontreinigingen dat niet zullen doen. De kritieke stappen van het protocol zijn (1) het verzamelen van een geschikt substraat, (2) het onderdompelen van het substraat, gewikkeld in een filtermateriaal, in water, (3) het verzamelen van wormen die door het filter zijn gegaan en naar de bodem van het water zijn gezonken, en (4) het isoleren van individuele wormen om isoofemale- of isohermafrodietlijnen te creëren. Alle andere delen van de methode kunnen indien nodig worden aangepast aan de beschikbare middelen, de aard van de substraten of de veldwerkdoelen. Enkele wijzigingen die het overwegen waard zijn, zijn als volgt.
De wormen lokken door fruit te planten
Als er op de veldplaats niet voldoende bacterierijk rottend materiaal te vinden is, kan men een monster, zoals een stuk appel of tomaat, meenemen om te laten rotten. Pin het aas goed vast met een paar staken zodat grotere dieren ze niet verwijderen en het later gemakkelijk kan worden gevonden om te verzamelen. Vermijd direct zonlicht, waar het aas kan drogen voordat het gaat rotten.
Het bouwen van trechterapparatuur uit alle beschikbare materialen
Elke structuur met gaten die groot genoeg zijn om de buisklem te huisvesten en stabiel genoeg om een topzware trechter te ondersteunen, zal werken. Voor een enkele trechter is een drinkglas een geschikte houder. Elk soort tissue – gezichtsdoekjes, toiletpapier of papieren handdoeken – kan worden gebruikt.
Minder materiaal in trechters stoppen, of de wachttijd aanpassen, om hypoxie of infectie te voorkomen
Als het monster een zeer hoge concentratie wormen of bacteriën heeft, kunnen nematoden beginnen te sterven aan hypoxie of infectie voordat de incubatie van 12 uur is voltooid. Als dit een probleem is, kan de onderzoeker trechters eerder controleren of een extra trechter voorbereiden met een zeer kleine substeekproef van het dichtbevolkte substraat.
De NGM-plaatvoorbereiding aanpassen aan experimentele behoeften en beperkingen
NGM-platen kunnen worden bereid met alle media en voedselbronnen die geschikt zijn voor het experiment. Het hierboven beschreven veldprotocol is ontworpen om het bagagegewicht te minimaliseren. Afhankelijk van de bagagebeperkingen en de timing van het veldwerk, kan het brengen van reeds gegoten NGM-platen – voorbereid in het laboratorium of commercieel gekocht – de voorkeur hebben in plaats van platen in het veld te gieten.
Het uitvoeren van de trechterisolaties in het laboratorium
Het protocol beschrijft het uitvoeren van de volledige procedure onder veldomstandigheden om de aaltjespopulatie te vangen zoals deze in de natuur voorkomt. Voor sommige onderzoeksdoelen kan het voldoende zijn om nematoden later te isoleren, nadat ze terug naar het laboratorium zijn gereisd met monsters in verzegelde zakken. Zelfs dan biedt de Baermann-trechtermethode een schoner en completer monster van de overlevende nematoden dan andere isolatiemethoden. Monsters in verzegelde zakken kunnen echter tijdens het reizen worden geselecteerd, omdat ze worden blootgesteld aan mogelijke extreme temperaturen en hypoxie. Dit kan worden geminimaliseerd door isolaties zo snel mogelijk na monsterverzameling uit te voeren.
Een veelgebruikte alternatieve methode voor de Baermann-trechter is het plaatsen van het substraat rechtstreeks op een NGM-plaat en wachten tot wormen eruit kruipen, wat ofwel zeer arbeidsintensief is of resulteert in de onvolledige verzameling van de populatie. Het levert ook platen op die besmet zijn met mijten en insectenlarven. De Baermann-trechtermethode is een goedkope, low-tech, low-labor strategie om snel de hele populatie actieve wormen van hun substraat te scheiden.
De Baermann trechtermethode is niet universeel toepasbaar voor het verzamelen van alle soorten wilde nematoden. Sommige plantenbewonende nematoden doen er veel langer dan 12 uur over om uit hun substraat te komen en zullen afwezig zijn van een druppel die te vroeg wordt vrijgegeven, terwijl sommige insectenparasieten naar de bovenkant van de trechter kruipen in plaats van naar de bodem, waardoor ook de verzameling wordt ontweken14. Alternatieven voor de Baermann-trechter vereisen meer gespecialiseerde apparatuur of meer arbeid om de wormen te herstellen. Ze kunnen echter nog steeds de voorkeur hebben als de bovenstaande kanttekeningen een probleem zijn voor het experiment. Alternatieve opties, beoordeeld door van Bezooijen14, omvatten de trechtersproeimethode, die een constante nevel van water aan trechters biedt, zuurstof toevoegt en de overloop van bacteriën in suspensie mogelijk maakt. Dit zorgt voor een langere extractieperiode van nematoden uit planten. De blender centrifugaal flotatie methode herstelt langzaam bewegende, inactieve of opwaarts kruipende nematoden door ze te scheiden door hun soortelijk gewicht, de Oostenbrink elutriator past een onderstroom toe om bezinkend sediment te scheiden van gesuspendeerde nematoden, en Cobb’s Methode gebruikt een reeks zeven om nematoden te isoleren op basis van hun grootte, vorm en sedimentatiesnelheid14. Om rhabditiden te verzamelen, produceert de Baermann-trechter echter snel en met minimale inspanning schone monsters.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH-beurzen R35GM141906 en R21ES031364 en Damon Runyon Fellowship DRG-2371-19.
Materials
| 1 L glass bottle | NA | NA | Step 1 – vessel for making plate media |
| 1 mL pipette tips | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
| 1 mL pipetter | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
| 35 mm worm plates | Tritech | T3500 | Step 1 – worm plates |
| 4mm ID rubber tubing | Fisher | 14178A | Step 3 – part of the funnel |
| 60 mm worm plates | Greiner | 628161 | Step 1 – worm plates |
| 65 mm Funnel | Fisher | 22170156 | Step 3 – part of the funnel |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | Step 1 – worm plate medium |
| Cooking pot | NA | NA | Step 1 – a water bath for melting the agar to pour plates |
| E. coli strain OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Step 1 – worm food |
| Field microscope | OMAX | G223CS | Step 6 – for viewing worms in the field |
| Fly vial storage tray | Azer Scientific | ES-260T | Step 3 – to build a platform to hold 12 funnels |
| Hot plate or stove | NA | NA | Step 1 – to heat the water bath |
| Kimwipes | KimberlyClark | 34120 | Step 4 – filter for the funnels |
| LB media | Gibco | 10855021 | Step 1 – for growing OP50 |
| Lighter | NA | NA | Step 6 – sterilize the worm pick |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Step 1 – worm plate medium |
| NGM-lite agar | USBiological | N1000 | Step 1 – worm plate medium |
| Parafilm M wrapping film | Fisher | 13-374-10 | Step 6 – pack worm plates for travel |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-500 | Step 1 – worm plate medium |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | P285-3 | Step 1 – worm plate medium |
| scalpel | NA | NA | Step 3 – cut holes for the funnels |
| scissors | NA | NA | Step 3 – cut the rubber tubing |
| Tape | NA | NA | Step 3 – tape the funnel holder together |
| Tubing clamps | Fisher | 5869 | Step 3 – part of the funnel |
| Worm pick | NA | NA | Step 6 – for isolating individual worms |
| Ziplock-style storage bags | NA | NA | Step 2 – to bag a substrate sample |
References
- Frezal, L., Felix, M. A. C. elegans outside the Petri dish. Elife. 4, 05849 (2015).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Reddy, K. C., et al. Antagonistic paralogs control a switch between growth and pathogen resistance in C. elegans. PLOS Pathogens. 15 (1), 1007528 (2019).
- Schulenburg, H., Felix, M. A. The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Andersen, E. C., et al. Chromosome-scale selective sweeps shape Caenorhabditis elegans genomic diversity. Nature Genetics. 44 (3), 285-290 (2012).
- Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource. Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2017).
- Crombie, T. A., et al. Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations. Elife. 8, 50465 (2019).
- Lee, D., et al. Balancing selection maintains hyper-divergent haplotypes in Caenorhabditis elegans. Nature Ecology & Evolution. 5 (6), 794-807 (2021).
- Rockman, M. V., Kruglyak, L. Recombinational landscape and population genomics of Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 5 (3), 1000419 (2009).
- Evans, K. S., van Wijk, M. H., McGrath, P. T., Andersen, E. C., Sterken, M. G. From QTL to gene: C. elegans facilitates discoveries of the genetic mechanisms underlying natural variation. Trends in Genetics. 37, 933-947 (2021).
- Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genetics Research (Cambridge Core). 92 (5-6), 331-348 (2010).
- Noble, L. M., Rockman, M. V., Teotonio, H. Gene-level quantitative trait mapping in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 11 (2), 061 (2021).
- Van Bezooijen, J. . Methods and techniques for nematology. , (2006).
- Barrièrre, A., Félix, M. -. A. Isolation of C. elegans. and related nematodes. Wormbook. , (2014).
- Baermann, G. Eine einfache Methode zur Auffindung von Anklostomum (Nematoden) Larven in Erdproben. Geneeskundig tijdschrift voor Nederlandsch-Indië. 57, 131-137 (1917).
- Gray, N. F. Ecology of nematophagous fungi Panagrellus redivivus as the target organism. Plant and Soil. 297, 293-297 (1983).
- Mallez, S., Castagnone, C., Espada, M., Viera, P., Eisenback, J., Mota, M., Guillemaud, T., Castagnone-Sereno, P. First insights into the genetic diversity of the pinewood nematode in its native area using new polymorphic microsatellite loci. PLOS ONE. 8 (3), 4-11 (2013).
- Kerfahi, D., Tripathi, M. B., Porazinska, L. D., Park, J., Go, R., Adams, M. J. Do tropical rain forest soils have greater nematode diversity than High Arctic tundra? A metagenetic comparison of Malaysia and Svalbard. Global Ecology and Biogeography. 25, 716-728 (2016).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application. PLOS ONE. 16, 0254293 (2021).
- Lints, R., Hall, D. H. Handbook of C. elegans male anatomy. WormAtlas. , (2005).
- Kiontke, K., Félix, M. -. A., Ailion, M., Rockman, M. V., Braendle, C., Pénigault, J. -. B., Fitch, D. H. A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits. BMC Evolutionary Biology. 11, 339 (2011).
