العزل السريع للديدان الخيطية البرية بواسطة قمع بيرمان
Summary
يحدد هذا البروتوكول طريقة لاستخراج الديدان الخيطية الحية بكفاءة من الركائز الطبيعية في هذا المجال.
Abstract
بالإضافة إلى كونها كائنات حية نموذجية تجريبية قوية ، فإن Caenorhabditis elegans وأقاربها هم أيضا حقيقية تعيش في الطبيعة. تعد دراسات الديدان الخيطية البرية في بيئاتها الطبيعية ذات قيمة لفهم العديد من جوانب علم الأحياء، بما في ذلك الأنظمة الانتقائية التي تتطور فيها السمات الجينومية والمظهرية المميزة، والأساس الجيني لاختلاف السمات المعقدة، والتنوع الجيني الطبيعي الأساسي لجميع مجموعات الحيوانات. تصف هذه المخطوطة طريقة بسيطة وفعالة لاستخراج الديدان الخيطية من ركائزها الطبيعية، بما في ذلك الفواكه المتعفنة والزهور والفطريات وفضلات الأوراق والتربة. طريقة قمع بايرمان ، وهي تقنية كلاسيكية في علم النيماتولوجيا ، تعزل بشكل انتقائي الديدان الخيطية النشطة عن ركائزها. نظرا لأنها تستعيد جميع الديدان النشطة تقريبا من العينة ، فإن تقنية قمع Baermann تسمح باستعادة الأنماط الجينية النادرة والبطيئة النمو التي تتزامن مع الأنماط الجينية الوفيرة وسريعة النمو ، والتي قد يتم تفويتها في طرق الاستخراج التي تنطوي على أجيال متعددة من التكاثر. كما أن هذه التقنية مناسبة تماما لمعالجة المسائل ما وراء الوراثية، والجينية السكانية، والبيئية. فهو يلتقط جميع السكان في عينة في وقت واحد ، مما يسمح برؤية غير متحيزة للتوزيع الطبيعي للأعمار والجنسين والأنماط الوراثية. يسمح البروتوكول بالنشر على نطاق واسع في الميدان ، وتحويل الركائز بسرعة إلى لوحات دودية ، وقد قام المؤلفون بالتحقق من صحته من خلال العمل الميداني في قارات متعددة.
Introduction
تظهر رؤى بيولوجية قيمة مع قيام الباحثين الذين يدرسون C. elegans في المختبر بتوسيع نطاق تركيزهم على C. elegans والديدان الخيطية الرابديتية ذات الصلة في البرية. تضع الدراسات التي أجريت على الديدان الخيطية البرية الجينات والجينومات في سياقها الطبيعي، وتكشف عن وظائف يحتمل أن تحجبها الظروف المختبرية1،2،3،4،5. تولد هذه الدراسات رؤى ثاقبة حول الشرط الأساسي للتطور نفسه ، التباين الجيني 6،7،8،9،10. كما يوفر التباين الجيني الطبيعي الذي تلتقطه العينات البرية طرقا في الأساس الجيني للعديد من السمات المعقدة11،12،13.
عند تصميم الدراسات التي تتطلب عزل المجموعات الطبيعية من الديدان الخيطية ، خاصة عند القيام بالعمل الميداني عن بعد ، تبرز الاعتبارات العملية في المقدمة. يهدف هذا البروتوكول إلى عزل مجموعات كاملة من الديدان الخيطية النشطة التي يمكن استزراعها على OP50 بشكل نظيف من الطعم أو الركائز البرية. هذه الطريقة مناسبة تماما لاستخراج الديدان الخيطية الرابديتيد والديبلوغاستريد التي تعيش بحرية ، بما في ذلك Caenorhabditis و Oscheius و Pristionchus.
هناك العديد من التقنيات لعزل الديدان الخيطية عن ركائزها14,15. النهج الأساسي هو وضع الركيزة مباشرة على صفيحة متوسطة الديدان الخيطية ، واختيار الحيوانات أثناء زحفها إلى الخارج8,15. تتطلب هذه الطريقة كميات كبيرة من الوقت والعمل إذا كان الهدف هو عزل جميع الديدان الخيطية من العينة. تستفيد التقنيات الأكثر تطورا من وزن الحيوانات أو حجمها أو حركتها أو مزيج من هذه التقنيات14. كل طريقة لها مزاياها وعيوبها من حيث الإعداد والإنتاجية. كما أنها تختلف في تحيزاتها لأخذ العينات وقد تختار لبعض الديدان الخيطية إذا كانت الحيوانات في العينة تختلف على طول محور مبدأ الفصل في الطريقة.
تم وصف طريقة قمع Baermann لأول مرة في عام 1917 من قبل الطبيب الهولندي G. K. T. F. Baermann ، الذي اخترع الجهاز على Java أثناء دراسة الديدان الخيطية التي تعيش في التربة ، بما في ذلك الدودة الخطافية الطفيلية16. يعمل قمع Baermann على أساس مبدأ التنقل. يتم وضع الركيزة في قمع مبطن بقطعة قماش أو مرشح ورقي (يتم استخدام “Kimwipe” لهذه الدراسة ، ويشار إليه باسم “مسح خال من الوبر” في البروتوكول الحالي) ومغلقة في الأسفل. ثم يتم ملء القمع بالماء ، وغمر العينة بينما يفصلها المرشح عن المخرج المغلق. تطلق الديدان الخيطية النشطة في العينة نفسها في الماء وتسبح عبر المرشح ، وتستقر في النهاية في الجزء السفلي من القمع. يتم فتح مخرج القمع ، ويتم طرد قطرة من الديدان الخيطية على طبق (الشكل 1).
الشكل 1: ملخص تقنية قمع بيرمان. (أ) جمع عينة غنية بالبكتيريا من موقع مثير للاهتمام. (ب) غمر العينة في قمع بيرمان وانتظار أن تتلوى الديدان وتغرق. (ج) إطلاق قطرة واحدة من القمع. (د) نقل خنثى واحد أو إناث متزاوجة إلى لوحات منفصلة. رسم توضيحي من إبداع رامين راني. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
لن يعمل قمع Baermann مع كل نوع من أنواع الديدان الخيطية (انظر قسم المناقشة للحصول على بدائل محددة) وهو الأنسب لتلك التي تكون أشكالا نشطة في نطاق حجم Caenorhabditis أو أصغر14. ومع ذلك ، إذا تمكنت الدراسة من استخدام قمع Baermann ، فهناك العديد من المزايا. هذه الطريقة عملية في هذا المجال ، وتتطلب إعدادا محدودا ووقتا عمليا وتكلفة. يترك الباحث مع عينة نظيفة دون إعاقة الركيزة على اللوحة ، مما يجعل الانتقاء سهلا. كما يمنع استخدام مرشح تلوث الصفيحة بواسطة يرقات الحشرات أو العث ، التي تمضغ الألواح أو تفترس الديدان الخيطية في العينة. الأهم من ذلك ، أن قمع Baermann يستخرج بكفاءة جميع السكان تقريبا من الركيزة14 ، والتي قد تكون مطلوبة اعتمادا على تصميم الدراسة. على سبيل المثال ، قد يستفيد الباحثون المهتمون بحساب مرحلة المجموعات البرية أو توزيعها الجنسي ، أو العثور على أنماط وراثية بطيئة النمو أو نادرة ، أو أخذ عينات من الديدان الخيطية غير المنجذبة إلى OP50 من هذه الطريقة. هذا مناسب للباحثين الذين يدرسون الأسئلة البيئية17 أو الجينية السكانية18 أو الميتافيزيقية19 حيث يأخذ مخطط أخذ العينات لقطة من السكان في وقت أخذ العينات.
تصف هذه المخطوطة بروتوكولا كاملا لعزل مجموعات الديدان الخيطية باستخدام قمع بيرمان وإنشاء خطوط متساوي التحمل وإيزو هيرمبروديت في الحقل، باستخدام معدات تم اختيارها لسهولة النقل. بالنسبة للباحثين الذين يجرون عملا ميدانيا بالقرب من مختبراتهم ، يمكن حذف العديد من هذه الخطوات أو تبسيطها.
Protocol
Representative Results
Discussion
المبدأ المركزي لهذه الطريقة هو أن الديدان الخيطية ستمر عبر الأنسجة المغمورة في الماء ، في حين أن الركيزة والملوثات اللافقارية الأكبر لن تفعل ذلك. تتمثل الخطوات الحاسمة للبروتوكول في (1) جمع ركيزة مناسبة ، (2) غمر الركيزة ، ملفوفة في مادة ترشيح ، في الماء ، (3) جمع الديدان التي مرت عبر المرشح وغرقت في قاع الماء ، و (4) عزل الديدان الفردية لإنشاء خطوط متساوي الثقل أو متساوي الخشوع. جميع الأجزاء الأخرى من الطريقة قابلة للتعديل حسب الضرورة وفقا للموارد المتاحة أو طبيعة الركائز أو أهداف العمل الميداني. بعض التعديلات التي تستحق النظر هي كما يلي.
اصطياد الديدان عن طريق زراعة الفاكهة
إذا لم يكن هناك إمدادات وافرة من المواد المتعفنة الغنية بالبكتيريا التي يمكن العثور عليها في الموقع الميداني ، فقد يرغب المرء في إحضار عينة ، مثل قطعة من التفاح أو الطماطم ، لتركها لتتعفن. قم بتثبيت الطعم جيدا مع بعض الرهانات حتى لا تقوم الحيوانات الكبيرة بإزالتها وبالتالي يمكن العثور عليها بسهولة في وقت لاحق لجمعها. تجنب أشعة الشمس المباشرة، حيث قد يجف الطعم قبل أن يتعفن.
بناء جهاز قمع من أي مواد متوفرة
أي هيكل به ثقوب كبيرة بما يكفي لاستيعاب مشبك الأنابيب ومستقر بما يكفي لدعم قمع ثقيل علوي سيعمل. بالنسبة لقمع واحد ، فإن كوب الشرب هو حامل مناسب. يمكن استخدام أي نوع من المناديل الورقية – مناديل الوجه أو ورق التواليت أو المناشف الورقية.
وضع مواد أقل في القمع، أو ضبط وقت الانتظار، لمنع نقص الأكسجة أو العدوى
إذا كانت العينة تحتوي على تركيز عال جدا من الديدان أو البكتيريا ، فقد تبدأ الديدان الخيطية في الموت من نقص الأكسجة أو العدوى قبل اكتمال الحضانة لمدة 12 ساعة. إذا كان هذا مصدر قلق ، فقد يتحقق الباحث من مسارات التحويل في وقت مبكر أو يعد قمعا إضافيا مع عينة فرعية صغيرة جدا من الركيزة ذات الكثافة السكانية العالية.
ضبط إعداد لوحة NGM وفقا للاحتياجات والقيود التجريبية
يمكن تحضير أطباق NGM بأي وسائط ومصدر غذائي مناسب للتجربة. تم تصميم البروتوكول الميداني الموضح أعلاه لتقليل وزن الأمتعة. اعتمادا على قيود الأمتعة وتوقيت العمل الميداني ، قد يكون من الأفضل إحضار لوحات NGM المصبوبة بالفعل – إما المعدة في المختبر أو التي تم شراؤها تجاريا – بدلا من صب الأطباق في الحقل.
إجراء عزل القمع في المختبر
يصف البروتوكول تنفيذ الإجراء الكامل في ظل الظروف الميدانية لالتقاط مجموعات الديدان الخيطية كما تحدث في الطبيعة. بالنسبة لبعض أهداف البحث ، قد يكون كافيا عزل الديدان الخيطية لاحقا ، بعد العودة إلى المختبر مع عينات في أكياس مغلقة. وحتى في هذه الحالة، توفر طريقة قمع بيرمان عينة أنظف وكاملة من الديدان الخيطية الباقية على قيد الحياة مقارنة بطرق العزل الأخرى. ومع ذلك ، قد تواجه العينات الموجودة في أكياس مغلقة الاختيار أثناء السفر ، لأنها تتعرض لدرجات الحرارة القصوى المحتملة ونقص الأكسجة. يمكن تقليل ذلك عن طريق إجراء عمليات العزل في أقرب وقت ممكن بعد جمع العينات.
تتضمن الطريقة البديلة الشائعة لقمع Baermann وضع الركيزة مباشرة على صفيحة NGM وانتظار زحف الديدان ، والتي إما كثيفة العمالة للغاية أو تؤدي إلى مجموعة غير مكتملة من السكان. كما أنه ينتج صفائح ملوثة بالعث ويرقات الحشرات. طريقة قمع Baermann هي استراتيجية منخفضة التكلفة ومنخفضة التقنية ومنخفضة العمالة لفصل جميع سكان الديدان النشطة بسرعة عن الركيزة.
طريقة قمع بيرمان ليست قابلة للتطبيق عالميا لجمع جميع أنواع الديدان الخيطية البرية. تستغرق بعض الديدان الخيطية التي تعيش في النباتات وقتا أطول بكثير من 12 ساعة للخروج من الركيزة الخاصة بها وستكون غائبة عن قطرة تطلق في وقت مبكر جدا ، في حين أن بعض طفيليات الحشرات سوف تزحف إلى أعلى القمع بدلا من الأسفل ، وتتهرب أيضا من التجميع14. تتطلب بدائل قمع Baermann إما معدات أكثر تخصصا أو المزيد من العمالة لاستعادة الديدان. ومع ذلك ، قد لا يزال يفضل إذا كانت المحاذير المذكورة أعلاه تمثل مشكلة للتجربة. وتشمل الخيارات البديلة، التي استعرضها فان بيزويين14، طريقة رش القمع، التي توفر ضبابا ثابتا من الماء إلى القمع، مما يضيف الأكسجين ويسمح بتدفق البكتيريا في التعليق. هذا يسمح لفترة استخراج أطول من الديدان الخيطية من النباتات. تستعيد طريقة التعويم بالطرد المركزي للخلاط الديدان الخيطية البطيئة الحركة أو غير النشطة أو الزاحفة لأعلى عن طريق فصلها حسب جاذبيتها النوعية ، ويطبق Oostenbrink elutriator تيارا سفليا لفصل الرواسب المستقرة عن الديدان الخيطية العالقة ، وتستخدم طريقة كوب سلسلة من المناخل لعزل الديدان الخيطية حسب حجمها وشكلها ومعدل ترسيبها14. لجمع rhabditids ، على الرغم من ذلك ، فإن قمع Baermann ينتج عينات نظيفة بشكل فعال بسرعة وبأقل جهد ممكن.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R35GM141906 و R21ES031364 وزمالة دامون رونيون DRG-2371-19.
Materials
| 1 L glass bottle | NA | NA | Step 1 – vessel for making plate media |
| 1 mL pipette tips | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
| 1 mL pipetter | any | NA | Step 1 – dispense worm media additives and seed plates |
| 35 mm worm plates | Tritech | T3500 | Step 1 – worm plates |
| 4mm ID rubber tubing | Fisher | 14178A | Step 3 – part of the funnel |
| 60 mm worm plates | Greiner | 628161 | Step 1 – worm plates |
| 65 mm Funnel | Fisher | 22170156 | Step 3 – part of the funnel |
| Calcium chloride | Fisher | C79-500 | Step 1 – worm plate medium |
| Cooking pot | NA | NA | Step 1 – a water bath for melting the agar to pour plates |
| E. coli strain OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Step 1 – worm food |
| Field microscope | OMAX | G223CS | Step 6 – for viewing worms in the field |
| Fly vial storage tray | Azer Scientific | ES-260T | Step 3 – to build a platform to hold 12 funnels |
| Hot plate or stove | NA | NA | Step 1 – to heat the water bath |
| Kimwipes | KimberlyClark | 34120 | Step 4 – filter for the funnels |
| LB media | Gibco | 10855021 | Step 1 – for growing OP50 |
| Lighter | NA | NA | Step 6 – sterilize the worm pick |
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Step 1 – worm plate medium |
| NGM-lite agar | USBiological | N1000 | Step 1 – worm plate medium |
| Parafilm M wrapping film | Fisher | 13-374-10 | Step 6 – pack worm plates for travel |
| Potassium phosphate dibasic | Fisher | BP363-500 | Step 1 – worm plate medium |
| Potassium phosphate monobasic | Fisher | P285-3 | Step 1 – worm plate medium |
| scalpel | NA | NA | Step 3 – cut holes for the funnels |
| scissors | NA | NA | Step 3 – cut the rubber tubing |
| Tape | NA | NA | Step 3 – tape the funnel holder together |
| Tubing clamps | Fisher | 5869 | Step 3 – part of the funnel |
| Worm pick | NA | NA | Step 6 – for isolating individual worms |
| Ziplock-style storage bags | NA | NA | Step 2 – to bag a substrate sample |
References
- Frezal, L., Felix, M. A. C. elegans outside the Petri dish. Elife. 4, 05849 (2015).
- Greene, J. S., et al. Balancing selection shapes density-dependent foraging behaviour. Nature. 539 (7628), 254-258 (2016).
- Reddy, K. C., et al. Antagonistic paralogs control a switch between growth and pathogen resistance in C. elegans. PLOS Pathogens. 15 (1), 1007528 (2019).
- Schulenburg, H., Felix, M. A. The natural biotic environment of Caenorhabditis elegans. Genetics. 206 (1), 55-86 (2017).
- Zhang, F., et al. Caenorhabditis elegans as a model for microbiome research. Frontiers in Microbiology. 8, 485 (2017).
- Andersen, E. C., et al. Chromosome-scale selective sweeps shape Caenorhabditis elegans genomic diversity. Nature Genetics. 44 (3), 285-290 (2012).
- Cook, D. E., Zdraljevic, S., Roberts, J. P., Andersen, E. C. CeNDR, the Caenorhabditis elegans natural diversity resource. Nucleic Acids Research. 45, 650-657 (2017).
- Crombie, T. A., et al. Deep sampling of Hawaiian Caenorhabditis elegans reveals high genetic diversity and admixture with global populations. Elife. 8, 50465 (2019).
- Lee, D., et al. Balancing selection maintains hyper-divergent haplotypes in Caenorhabditis elegans. Nature Ecology & Evolution. 5 (6), 794-807 (2021).
- Rockman, M. V., Kruglyak, L. Recombinational landscape and population genomics of Caenorhabditis elegans. PLOS Genetics. 5 (3), 1000419 (2009).
- Evans, K. S., van Wijk, M. H., McGrath, P. T., Andersen, E. C., Sterken, M. G. From QTL to gene: C. elegans facilitates discoveries of the genetic mechanisms underlying natural variation. Trends in Genetics. 37, 933-947 (2021).
- Gaertner, B. E., Phillips, P. C. Caenorhabditis elegans as a platform for molecular quantitative genetics and the systems biology of natural variation. Genetics Research (Cambridge Core). 92 (5-6), 331-348 (2010).
- Noble, L. M., Rockman, M. V., Teotonio, H. Gene-level quantitative trait mapping in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 11 (2), 061 (2021).
- Van Bezooijen, J. . Methods and techniques for nematology. , (2006).
- Barrièrre, A., Félix, M. -. A. Isolation of C. elegans. and related nematodes. Wormbook. , (2014).
- Baermann, G. Eine einfache Methode zur Auffindung von Anklostomum (Nematoden) Larven in Erdproben. Geneeskundig tijdschrift voor Nederlandsch-Indië. 57, 131-137 (1917).
- Gray, N. F. Ecology of nematophagous fungi Panagrellus redivivus as the target organism. Plant and Soil. 297, 293-297 (1983).
- Mallez, S., Castagnone, C., Espada, M., Viera, P., Eisenback, J., Mota, M., Guillemaud, T., Castagnone-Sereno, P. First insights into the genetic diversity of the pinewood nematode in its native area using new polymorphic microsatellite loci. PLOS ONE. 8 (3), 4-11 (2013).
- Kerfahi, D., Tripathi, M. B., Porazinska, L. D., Park, J., Go, R., Adams, M. J. Do tropical rain forest soils have greater nematode diversity than High Arctic tundra? A metagenetic comparison of Malaysia and Svalbard. Global Ecology and Biogeography. 25, 716-728 (2016).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
- Di Bernardo, M., Crombie, T. A., Cook, D. E., Andersen, E. C. easyFulcrum: An R package to process and analyze ecological sampling data generated using the Fulcrum mobile application. PLOS ONE. 16, 0254293 (2021).
- Lints, R., Hall, D. H. Handbook of C. elegans male anatomy. WormAtlas. , (2005).
- Kiontke, K., Félix, M. -. A., Ailion, M., Rockman, M. V., Braendle, C., Pénigault, J. -. B., Fitch, D. H. A phylogeny and molecular barcodes for Caenorhabditis, with numerous new species from rotting fruits. BMC Evolutionary Biology. 11, 339 (2011).
