Determinación del papel de los genes expresados por la madre en el desarrollo temprano con crispants maternos

Un conjunto de productos depositados por la madre (por ejemplo, ARN, proteínas y otras biomoléculas) es necesario para todos los procesos celulares tempranos hasta que se active el genoma cigótico del embrión¹. El agotamiento prematuro de estos productos del ovocito es típicamente letal embrionario. A pesar de la importancia de estos genes en el desarrollo, el papel de muchos genes expresados por la madre es actualmente desconocido. El avance en la tecnología de edición de genes en el pez cebra, como CRISPR-Cas9, permite la focalización de genes expresados maternamente ^2,3,4. Sin embargo, la identificación de un fenotipo de efecto materno requiere una generación adicional en comparación con un fenotipo cigótico, por lo que requiere más recursos. Recientemente, la capacidad de edición bialélica de CRISPR-Cas9 se ha utilizado para detectar fenotipos embrionarios en tejidos somáticos de embriones inyectados (F0), conocidos como “crispantes”5,6,7,8,9,10. La técnica crispant permite la detección eficiente de genes candidatos en células somáticas, facilitando la comprensión de aspectos específicos en el desarrollo. El protocolo descrito en este trabajo permite la identificación de fenotipos de efecto materno, o “crispantes maternos”, en una sola generación¹¹. Este esquema se puede lograr mediante la multiplexación de ARN guía a un solo gen y la promoción de eventos de edición bialélica en la línea germinal. Estos embriones maternos crispantes pueden identificarse por fenotipos morfológicos macroscópicos y someterse a una caracterización primaria, como el etiquetado de los límites celulares y el patrón de ADN¹¹. El análisis combinado del fenotipo observable y la caracterización molecular básica de los INDEL inducidos permite predecir el papel del gen objetivo en el desarrollo temprano.

En el pez cebra, durante las primeras 24 h después de la fertilización (hpf), un pequeño grupo de células se convierte en las células germinales primordiales, un precursor de la línea germinal^12,13,14,15. En las garras colocadas por hembras F0, la proporción de embriones maternos crispantes recuperados depende de cuántas células germinales contienen un evento de edición bialélico en el gen objetivo. En general, cuanto antes ocurra el evento de edición en el embrión, mayor será la probabilidad de que se observen mutaciones CRISPR-Cas9 en la línea germinal. En la mayoría de los casos, los fenotipos de embriones crujientes maternos provienen de la pérdida de función en los dos alelos maternos presentes en el ovocito en desarrollo. A medida que el ovocito termina la meiosis, uno de los alelos maternos se extruye del embrión a través del cuerpo polar, mientras que el otro alelo se incorpora al pronúcleo materno. La secuenciación de múltiples haploides crujientes maternos representará una mezcla de las mutaciones (inserciones y/o deleciones (INDELs)) presentes en la línea germinal que contribuyen al fenotipo¹¹.

El siguiente protocolo describe los pasos necesarios para crear mutaciones CRISPR-Cas9 en genes de efecto materno e identificar el fenotipo correspondiente utilizando un enfoque de crispante materno (Figura 1). La sección uno explicará cómo diseñar y crear ARN guía de manera efectiva, mientras que las secciones dos y tres contienen pasos críticos para crear crispantes maternos mediante microinyección. Después de inyectar la mezcla CRISPR-Cas9, los embriones inyectados se examinan para detectar ediciones somáticas mediante PCR (sección cuatro). Una vez que los embriones F0 inyectados se desarrollan y alcanzan la madurez sexual, las hembras F0 se cruzan con machos de tipo salvaje, y sus crías son examinadas para detectar fenotipos de efecto materno (sección cinco). La sección seis incluye instrucciones sobre cómo hacer haploides crujientes maternos que se pueden combinar con la secuenciación de Sanger para identificar los INDEL inducidos por CRISPR-Cas9. Además, la Discusión contiene modificaciones que se pueden hacer al protocolo para aumentar la sensibilidad y el poder de este método.