母体クリスパントによる初期発生における母体発現遺伝子の役割の決定

母体寄託産物(RNA、タンパク質、その他の生体分子など)のプールは、胚の接合子ゲノムが活性化されるまでのすべての初期の細胞プロセスに必要です¹。卵母細胞からのこれらの産物の時期尚早の枯渇は、典型的には胚性致死性である。発生におけるこれらの遺伝子の重要性にもかかわらず、多くの母体発現遺伝子の役割は現在不明です。CRISPR-Cas9などのゼブラフィッシュの遺伝子編集技術の進歩により、母体発現遺伝子の標的化が可能になりました^2,3,4。ただし、母性効果表現型の同定には、接合子表現型と比較して余分な生成が必要であり、したがって、より多くのリソースが必要です。最近、CRISPR-Cas9の双対立遺伝子編集機能は、「クリスパント」として知られる注射された(F0)胚の体細胞組織における胚表現型のスクリーニングに使用されています5,6,7,8,9,10。クリスパント技術は、体細胞内の候補遺伝子の資源効率の高いスクリーニングを可能にし、発生における特定の側面の理解を容易にします。この論文で説明されているプロトコルは、単一の世代¹¹で母性効果表現型、または「母体クリスパント」の同定を可能にします。このスキームは、ガイドRNAを単一の遺伝子にマルチプレックスし、生殖細胞系列における双対立遺伝子編集イベントを促進することによって達成可能です。これらの母体のクリスパント胚は、肉眼的形態学的表現型によって識別することができ、細胞境界の標識やDNAパターニングなどの一次特性評価を受ける^{ことができます11}。誘導されたINDELの観察可能な表現型と基本的な分子特性を組み合わせた解析により、初期発生における標的遺伝子の役割を予測することができます。

ゼブラフィッシュでは、受精後最初の24時間(hpf)の間に、細胞の小さなグループが生殖系列^12,13,14,15の前駆細胞である始原生殖細胞に発達します。F0雌が産んだクラッチでは、回収される母体のクリスパント胚の割合は、標的遺伝子に双対立遺伝子編集イベントを含む生殖細胞の数によって異なります。一般に、編集イベントが胚で早く発生するほど、生殖系列でCRISPR-Cas9変異が観察される可能性が高くなります。ほとんどの場合、母体のクリスパント胚の表現型は、発生中の卵母細胞に存在する2つの母体の対立遺伝子の機能の喪失に由来します。卵母細胞が減数分裂を終了すると、母体の対立遺伝子の1つが極体を介して胚から押し出され、もう一方の対立遺伝子が母体の前核に取り込まれます。複数の母体のクリスパント一倍体の配列決定は、表現型¹¹に寄与する生殖細胞系列に存在する突然変異(挿入および/または欠失(INDEL))の混合物を表します。

以下のプロトコルでは、母体効果遺伝子にCRISPR-Cas9変異を作成し、母体クリスパントアプローチを使用して対応する表現型を特定するために必要な手順を説明しています(図1)。セクション1では、ガイドRNAを効果的に設計および作成する方法を説明しますが、セクション2と3には、マイクロインジェクションによって母体のクリスパンを作成するための重要なステップが含まれています。CRISPR-Cas9混合物を注入した後、注入された胚はPCRを介して体細胞編集についてスクリーニングされます(セクション4)。注入されたF0胚が発達して性的成熟に達すると、F0メスは野生型のオスに交配され、その子孫は母親効果表現型についてスクリーニングされます(セクション5)。セクション6には、CRISPR-Cas9誘発INDELを特定するためにサンガーシーケンシングと組み合わせることができる母体のクリスパント一倍体の作成に関する指示が含まれています。さらに、ディスカッションには、この方法の感度とパワーを高めるためにプロトコルに加えることができる変更が含まれています。