Het bepalen van de rol van maternale tot expressie gebrachte genen in de vroege ontwikkeling met maternale crispants

Een pool van maternale afgezette producten (bijv. RNA’s, eiwitten en andere biomoleculen) is noodzakelijk voor alle vroege cellulaire processen totdat het zygote genoom van het embryo wordt geactiveerd¹. De voortijdige uitputting van deze producten uit de eicel is typisch embryonaal dodelijk. Ondanks het belang van deze genen in de ontwikkeling, is de rol van veel moederlijk tot expressie gebrachte genen momenteel onbekend. Vooruitgang in genbewerkingstechnologie in zebravissen, zoals CRISPR-Cas9, maakt het mogelijk om moederlijk tot expressie gebrachte genen^te richten ^2,3,4. De identificatie van een fenotype met maternale effecten vereist echter een extra generatie in vergelijking met een zygotisch fenotype, waardoor meer middelen nodig zijn. Onlangs is de biallelische bewerkingsmogelijkheid van CRISPR-Cas9 gebruikt om te screenen op embryonale fenotypen in somatische weefsels van geïnjecteerde (F0) embryo’s, bekend als “crispants”5,6,7,8,9,10. De crispant-techniek maakt resource-efficiënte screening van kandidaatgenen in somatische cellen mogelijk, waardoor het begrip van specifieke aspecten in ontwikkeling wordt vergemakkelijkt. Het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, maakt de identificatie mogelijk van fenotypen met maternale effecten, of “maternale crispants”, in een enkele generatie¹¹. Dit schema is haalbaar door RNA’s te multiplexen naar een enkel gen en biallelische bewerkingsgebeurtenissen in de kiembaan te bevorderen. Deze maternale crispante embryo’s kunnen worden geïdentificeerd door grove morfologische fenotypen en ondergaan primaire karakterisering, zoals etikettering voor celgrenzen en DNA-patronen¹¹. Gecombineerde analyse van het waarneembare fenotype en elementaire moleculaire karakterisering van de geïnduceerde INDELs maakt het mogelijk om de rol van het beoogde gen in de vroege ontwikkeling te voorspellen.

Bij zebravissen ontwikkelt zich tijdens de eerste 24 uur na de bevruchting (hpf) een kleine groep cellen tot de primordiale geslachtscellen, een voorloper van de kiembaan 12,13,14,15. In klauwen gelegd door F0-vrouwtjes hangt het aandeel van de maternale crispant-embryo’s die worden hersteld af van het aantal geslachtscellen dat een biallelische bewerkingsgebeurtenis in het beoogde gen bevat. Over het algemeen geldt dat hoe eerder de bewerkingsgebeurtenis in het embryo plaatsvindt, hoe groter de kans dat CRISPR-Cas9-mutaties in de kiembaan worden waargenomen. In de meeste gevallen zijn de fenotypen van maternale crispante embryo’s afkomstig van het verlies van functie in de twee maternale allelen die aanwezig zijn in de zich ontwikkelende eicel. Naarmate de eicel meiose voltooit, wordt een van de maternale allelen via het polaire lichaam uit het embryo geëxtrudeerd, terwijl het andere allel wordt opgenomen in de maternale pronucleus. De sequencing van meerdere maternale crispante haploïden vertegenwoordigt een mengsel van de mutaties (inserties en/of deleties (INDELs)) die aanwezig zijn in de kiembaan en die bijdragen aan fenotype¹¹.

Het volgende protocol beschrijft de noodzakelijke stappen om CRISPR-Cas9-mutaties in maternale-effectgenen te creëren en het overeenkomstige fenotype te identificeren met behulp van een maternale crispantbenadering (figuur 1). In sectie één wordt uitgelegd hoe u effectief gids-RNA’s kunt ontwerpen en maken, terwijl secties twee en drie kritieke stappen bevatten voor het maken van maternale crispants door micro-injectie. Na het injecteren van het CRISPR-Cas9 mengsel worden geïnjecteerde embryo’s gescreend op somatische bewerkingen via PCR (sectie vier). Zodra de geïnjecteerde F0-embryo’s zich ontwikkelen en geslachtsrijp zijn, worden de F0-vrouwtjes gekruist met mannetjes van het wilde type en worden hun nakomelingen gescreend op fenotypen met maternale effecten (sectie vijf). Sectie zes bevat instructies voor het maken van maternale crispante haploïden die kunnen worden gecombineerd met Sanger-sequencing om de CRISPR-Cas9-geïnduceerde INDELs te identificeren. Daarnaast bevat de discussie wijzigingen die in het protocol kunnen worden aangebracht om de gevoeligheid en kracht van deze methode te vergroten.