Determinare il ruolo dei geni espressi per via materna nello sviluppo precoce con i crispanti materni

Un pool di prodotti depositati per la madre (ad esempio, RNA, proteine e altre biomolecole) è necessario per tutti i processi cellulari precoci fino all’attivazione del genoma zigotico dell’embrione¹. L’esaurimento prematuro di questi prodotti dall’ovocita è tipicamente letale embrionale. Nonostante l’importanza di questi geni nello sviluppo, il ruolo di molti geni espressi per via materna è attualmente sconosciuto. I progressi nella tecnologia di modifica genetica nei pesci zebra, come CRISPR-Cas9, consentono il targeting dei geni espressi per via materna ^2,3,4. Tuttavia, l’identificazione di un fenotipo con effetto materno richiede una generazione in più rispetto a un fenotipo zigotico, richiedendo quindi più risorse. Recentemente, la capacità di editing biallelico di CRISPR-Cas9 è stata utilizzata per lo screening di fenotipi embrionali in tessuti somatici di embrioni iniettati (F0), noti come “crispants”5,6,7,8,9,10. La tecnica crispant consente uno screening efficiente in termini di risorse dei geni candidati nelle cellule somatiche, facilitando la comprensione di aspetti specifici nello sviluppo. Il protocollo descritto in questo documento consente l’identificazione di fenotipi di effetti materni, o “crispanti materni”, in una singola generazione¹¹. Questo schema è ottenibile moltiplicando gli RNA guida in un singolo gene e promuovendo eventi di editing biallelico nella linea germinale. Questi embrioni materni crispanti possono essere identificati da fenotipi morfologici grossolani e sottoposti a caratterizzazione primaria, come l’etichettatura per i confini cellulari e il pattern del DNA¹¹. L’analisi combinata del fenotipo osservabile e la caratterizzazione molecolare di base degli INDEL indotti consente di prevedere il ruolo del gene bersaglio nello sviluppo precoce.

Nel pesce zebra, durante le prime 24 ore dopo la fecondazione (hpf), un piccolo gruppo di cellule si sviluppa nelle cellule germinali primordiali, un precursore della linea germinale^12,13,14,15. Nelle frizioni deposte dalle femmine F0, la proporzione di embrioni materni di crispant recuperati dipende da quante cellule germinali contengono un evento di editing biallelico nel gene bersaglio. In generale, prima si verifica l’evento di editing nell’embrione, maggiore è la probabilità che si osservino mutazioni CRISPR-Cas9 nella linea germinale. Nella maggior parte dei casi, i fenotipi degli embrioni materni crispanti derivano dalla perdita di funzione nei due alleli materni presenti nell’ovocita in via di sviluppo. Quando l’ovocita termina la meiosi, uno degli alleli materni viene estruso dall’embrione attraverso il corpo polare, mentre l’altro allele viene incorporato nel pronucleo materno. Il sequenziamento di aploidi crispanti materni multipli rappresenterà una miscela delle mutazioni (inserzioni e/o delezioni (INDEL)) presenti nella linea germinale che contribuiscono al fenotipo¹¹.

Il seguente protocollo descrive i passi necessari per creare mutazioni CRISPR-Cas9 nei geni con effetto materno e identificare il fenotipo corrispondente utilizzando un approccio crispante materno (Figura 1). La prima sezione spiegherà come progettare e creare efficacemente RNA guida, mentre le sezioni due e tre contengono passaggi critici per la creazione di crispanti materni mediante microiniezione. Dopo aver iniettato la miscela CRISPR-Cas9, gli embrioni iniettati vengono sottoposti a screening per modifiche somatiche tramite PCR (sezione quattro). Una volta che gli embrioni F0 iniettati si sviluppano e raggiungono la maturità sessuale, le femmine F0 vengono incrociate con maschi wild-type e la loro prole viene sottoposta a screening per fenotipi di effetti materni (sezione cinque). La sesta sezione include istruzioni su come produrre aploidi crispanti materni che possono essere combinati con il sequenziamento Sanger per identificare gli INDEL indotti da CRISPR-Cas9. Inoltre, la discussione contiene modifiche che possono essere apportate al protocollo per aumentare la sensibilità e la potenza di questo metodo.