Determinando o papel dos genes materno-expressos no desenvolvimento inicial com crispants maternos

Um conjunto de produtos depositados maternalmente (por exemplo, RNAs, proteínas e outras biomoléculas) é necessário para todos os processos celulares iniciais até que o genoma zigótico do embrião seja ativado¹. O esgotamento prematuro desses produtos do ovócito é tipicamente letal embrionário. Apesar da importância desses genes no desenvolvimento, o papel de muitos genes expressos maternalmente é atualmente desconhecido. O avanço da tecnologia de edição de genes em peixes-zebra, como o CRISPR-Cas9, possibilita o direcionamento de genes expressos maternalmente ^2,3,4. No entanto, a identificação de um fenótipo de efeito materno requer uma geração extra quando comparada a um fenótipo zigótico, necessitando, portanto, de mais recursos. Recentemente, a capacidade de edição bialélica da CRISPR-Cas9 tem sido utilizada para rastrear fenótipos embrionários em tecidos somáticos de embriões injetados (F0), conhecidos como “crispants”5,6,7,8,9,10. A técnica crispante permite a triagem eficiente em termos de recursos de genes candidatos em células somáticas, facilitando a compreensão de aspectos específicos no desenvolvimento. O protocolo descrito neste trabalho permite a identificação de fenótipos de efeito materno, ou “crispants maternos”, em uma única geração¹¹. Este esquema é alcançável pela multiplexação de RNAs guia para um único gene e promovendo eventos de edição bialélica na linha germinativa. Esses embriões crispantes maternos podem ser identificados por fenótipos morfológicos macroscópicas e submetidos à caracterização primária, como marcação para limites celulares e padronização do DNA¹¹. A análise combinada do fenótipo observável e a caracterização molecular básica dos INDELs induzidos permitem a previsão do papel do gene alvo no desenvolvimento inicial.

No peixe-zebra, durante as primeiras 24 h pós-fertilização (hpf), um pequeno grupo de células se desenvolve nas células germinativas primordiais, precursoras da linha germinativa^12,13,14,15. Nas garras colocadas por fêmeas F0, a proporção de embriões crispantes maternos recuperados depende de quantas células germinativas contêm um evento de edição bialélico no gene alvo. Em geral, quanto mais cedo o evento de edição ocorrer no embrião, maior a probabilidade de mutações CRISPR-Cas9 serem observadas na linha germinativa. Na maioria dos casos, os fenótipos de embriões crispantes maternos vêm da perda de função nos dois alelos maternos presentes no ovócito em desenvolvimento. À medida que o ovócito termina a meiose, um dos alelos maternos é extrudado do embrião através do corpo polar, enquanto o outro alelo é incorporado ao pronúcleo materno. O sequenciamento de múltiplos haploides crispantes maternos representará uma mistura das mutações (inserções e/ou deleções (INDELs)) presentes na linha germinativa que contribuem para o fenótipo¹¹.

O protocolo a seguir descreve as etapas necessárias para criar mutações CRISPR-Cas9 em genes de efeito materno e identificar o fenótipo correspondente usando uma abordagem materna crispante (Figura 1). A seção um explicará como efetivamente projetar e criar RNAs guia, enquanto as seções dois e três contêm etapas críticas para a criação de crispants maternos por microinjeção. Após a injeção da mistura CRISPR-Cas9, os embriões injetados são rastreados para edições somáticas via PCR (secção quatro). Uma vez que os embriões F0 injetados se desenvolvem e atingem a maturidade sexual, as fêmeas F0 são cruzadas para machos selvagens e seus descendentes são rastreados para fenótipos de efeito materno (seção cinco). A seção seis inclui instruções sobre como fazer haploides crispantes maternos que podem ser combinados com o sequenciamento de Sanger para identificar os INDELs induzidos por CRISPR-Cas9. Além disso, a Discussão contém modificações que podem ser feitas no protocolo para aumentar a sensibilidade e o poder desse método.