Déterminer le rôle des gènes exprimés par la mère dans le développement précoce des croustillants maternels

Un pool de produits déposés par la mère (par exemple, ARN, protéines et autres biomolécules) est nécessaire pour tous les processus cellulaires précoces jusqu’à ce que le génome zygotique de l’embryon soit activé¹. L’épuisement prématuré de ces produits de l’ovocyte est généralement létal embryonnaire. Malgré l’importance de ces gènes dans le développement, le rôle de nombreux gènes exprimés par la mère est actuellement inconnu. Les progrès de la technologie d’édition de gènes chez le poisson zèbre, tels que CRISPR-Cas9, permettent de cibler les gènes exprimés par la mère ^2,3,4. Cependant, l’identification d’un phénotype d’effet maternel nécessite une génération supplémentaire par rapport à un phénotype zygotique, nécessitant ainsi plus de ressources. Récemment, la capacité d’édition biallélique de CRISPR-Cas9 a été utilisée pour dépister les phénotypes embryonnaires dans les tissus somatiques d’embryons injectés (F0), connus sous le nom de « crispants »5,6,7,8,9,10. La technique de crispant permet un criblage efficace des gènes candidats dans les cellules somatiques, facilitant ainsi la compréhension des aspects spécifiques du développement. Le protocole décrit dans cet article permet d’identifier les phénotypes de l’effet maternel, ou « crispants maternels », en une seule génération¹¹. Ce schéma est réalisable en multiplexant les ARN guides vers un seul gène et en favorisant les événements d’édition bialléliques dans la lignée germinale. Ces embryons maternels crispants peuvent être identifiés par des phénotypes morphologiques macroscopiques et faire l’objet d’une caractérisation primaire, telle que l’étiquetage des limites cellulaires et la structuration de l’ADN¹¹. L’analyse combinée du phénotype observable et la caractérisation moléculaire de base des INDEL induites permettent de prédire le rôle du gène ciblé dans le développement précoce.

Chez le poisson zèbre, au cours des premières 24 heures post-fécondation (HPF), un petit groupe de cellules se développe dans les cellules germinales primordiales, un précurseur de la lignée germinale^12,13,14,15. Dans les couvées pondues par les femelles F0, la proportion d’embryons maternels crispants récupérés dépend du nombre de cellules germinales contenant un événement d’édition biallélique dans le gène ciblé. En général, plus l’événement d’édition se produit tôt dans l’embryon, plus la probabilité que des mutations CRISPR-Cas9 soient observées dans la lignée germinale est élevée. Dans la plupart des cas, les phénotypes des embryons maternels crispants proviennent de la perte de fonction des deux allèles maternels présents dans l’ovocyte en développement. Lorsque l’ovocyte termine la méiose, l’un des allèles maternels est extrudé de l’embryon via le corps polaire, tandis que l’autre allèle est incorporé dans le pronucleus maternel. Le séquençage de multiples haploïdes maternels crispants représentera un mélange des mutations (insertions et/ou délétions (INDEL)) présentes dans la lignée germinale qui contribuent au phénotype¹¹.

Le protocole suivant décrit les étapes nécessaires pour créer des mutations CRISPR-Cas9 dans les gènes de l’effet maternel et identifier le phénotype correspondant à l’aide d’une approche de crispant maternel (Figure 1). La première section expliquera comment concevoir et créer efficacement des ARN guides, tandis que les sections deux et trois contiennent des étapes critiques pour la création de crispants maternels par micro-injection. Après l’injection du mélange CRISPR-Cas9, les embryons injectés sont examinés pour les modifications somatiques par PCR (section quatre). Une fois que les embryons F0 injectés se développent et atteignent la maturité sexuelle, les femelles F0 sont croisées avec des mâles de type sauvage, et leur progéniture est examinée pour les phénotypes d’effet maternel (section cinq). La section six comprend des instructions sur la fabrication d’haploïdes maternels crispants qui peuvent être combinés avec le séquençage de Sanger pour identifier les INDEL induites par CRISPR-Cas9. En outre, la discussion contient des modifications qui peuvent être apportées au protocole pour augmenter la sensibilité et la puissance de cette méthode.