Глубокие и пространственно контролируемые объемные абляции с использованием двухфотонного микроскопа в гаструле рыбок данио

Клеточно-клеточные взаимодействия играют жизненно важную роль в развитии. Клетки предоставляют сигналы, которые могут воспринимать их прямые соседи или клетки, находящиеся дальше, тем самым влияя на их судьбу и / или поведение. Многие из этих сигналов носят химический характер. Например, в хорошо охарактеризованных событиях индукции одна группа клеток производит диффузные молекулы, влияющие на судьбу другой клеточной ^{популяции1}. Другие сигналы, однако, являются механическими; клетки оказывают на соседей силы и ограничения, которые соседи воспринимают и на которые ^{реагируют2}.

Одним из способов изучения важности этих клеточно-клеточных взаимодействий in vivo является устранение некоторых клеток и наблюдение за последующим развитием. К сожалению, доступные методы удаления или уничтожения клеток ограничены. Клетки могут быть удалены хирургическим ^{путем3,4} с помощью игл или небольших проводов, но такие методы лечения являются инвазивными, не очень точными и обычно выполняются под стереомикроскопом, предотвращая немедленную визуализацию под микроскопом. Кроме того, нацеливание на глубокие клетки подразумевает прокалывание отверстия в вышележащих тканях, создавая нежелательные возмущения. Генетически закодированные фотосенсибилизаторы, такие как KillerRed, использовались для индуцирования гибели клеток с помощью светового ^{освещения5}. Фотосенсибилизаторы представляют собой хромофоры, которые генерируют активные формы кислорода при световом облучении. Их основным ограничением является то, что они требуют длительного светового освещения (около 15 минут), чего может быть трудно достичь, если клетки движутся, и что они вызывают гибель клеток через апоптоз, который не является немедленным.

Наконец, лазерные абляции были разработаны и широко используются в последние 15 лет6,7,8,9,10,11,12. Лазерный луч фокусируется на целевой клетке/ткани. Он индуцирует его абляцию посредством нагревания, фотоабляции или плазменной абляции; задействованный процесс зависит от плотности мощности и времени ^{экспозиции13}. Большинство протоколов абляции используют УФ-лазеры для их высокой энергии. Однако ультрафиолетовый свет поглощается и рассеивается биологическими тканями. Таким образом, нацеливание на глубокие клетки требует высокой мощности лазера, который затем вызывает повреждения в более поверхностных, внеплановых тканях. Это ограничивает использование УФ-лазеров поверхностными структурами и объясняет их относительно низкое осевое разрешение. Нелинейная оптика (так называемая двухфотонная микроскопия) использует нелинейные свойства света для возбуждения флуорофора двумя фотонами примерно половинной энергии в инфракрасной области. При применении к абляциям это имеет три основных преимущества. Во-первых, инфракрасный свет меньше рассеивается и меньше поглощается биологическими тканями, чем ультрафиолетовый ^свет14, что позволяет достигать более глубоких структур без увеличения необходимой мощности лазера. Во-вторых, использование фемтосекундного импульсного лазера обеспечивает очень высокие плотности мощности, создавая абляцию за счет плазменной индукции, которая, в отличие от нагрева, не диффундирует ^{пространственно15}. В-третьих, плотность мощности, индуцирующая плазмообразование, достигается только в фокальной точке. Благодаря этим свойствам двухфотонная лазерная абляция может быть использована для точного нацеливания на глубокие клетки, не влияя на окружающую среду тканей.

Коллективные миграции являются отличным примером процессов развития, в которых взаимодействие клеток и клеток является фундаментальным. Коллективные миграции определяются как миграции клеток, в которых соседние клетки влияют на поведение одной ^{клетки16}. Природа этих взаимодействий (химических или механических) и то, как они влияют на миграцию клеток, может сильно различаться и часто не совсем понятна. Способность удалять клетки и наблюдать, как это влияет на других, имеет решающее значение для дальнейшего разгадывания этих коллективных процессов. Несколько лет назад мы установили — используя хирургические подходы — что миграция полстера во время гаструляции рыбок данио является коллективной ^{миграцией17}. Полстер представляет собой группу клеток, которые составляют первые интернализующие клетки на дорсальной стороне ^{эмбриона18}. Эти клетки, помеченные зеленым цветом в трансгенной линии Tg(gsc:GFP), расположены глубоко в эмбрионе, ниже нескольких слоев клеток эпибластов. Во время гаструляции эта группа возглавляет расширение осевой мезодермы, мигрируя от эмбрионального органайзера к полюсу животного19,20,21,22,23 (рисунок 1А). Мы установили, что клеткам требуется контакт со своими соседями, чтобы сориентировать свою миграцию в направлении полюса животных. Тем не менее, лучшее понимание клеточных и молекулярных основ этой коллективной миграции включает в себя удаление некоторых клеток, чтобы увидеть, как это влияет на оставшиеся. Поэтому мы разработали абляции больших и глубоких объемов с использованием двухфотонной микроскопической установки. Здесь мы демонстрируем использование этого протокола для разрыва полстера в его середине и наблюдаем последствия миграции клеток путем отслеживания ядер, помеченных Histone2B-mCherry.